丹參素聯(lián)合DickkopF-1抗體對大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化Wnt-β-catenin通路的影響.pdf

1、目的:
　　Wnt/β-catenin通路影響骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移，調(diào)控其分化方向?；罨疻nt/β-catenin途徑能促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，而屬Dickkopf家族的Dickkopf-1(DKK-1)能夠抑制此途徑。我們的研究曾發(fā)現(xiàn)，丹參素有抗骨質(zhì)疏松作用，與其能夠調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，刺激骨鈣素分泌，促進(jìn)骨形成有關(guān)，但作用機(jī)制尚不明確。本研究通過觀察丹參素對體外大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mar

2、row stromal stem cells，BMSCs）成骨分化能力的影響，以探討丹參素對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化方向的調(diào)節(jié)作用;通過對比丹參素與DKK-1抗體對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響，以及對調(diào)控骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化方向的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中的Dickkopf-1、β-catenin基因及蛋白表達(dá)的影響，以探討丹參素對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化方向調(diào)控的作用機(jī)制。為丹參素用于防治骨質(zhì)疏松方面提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:<

3、br>　　通過傳代貼壁篩選法分離純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。應(yīng)用細(xì)胞表面抗原CD45、CD90雙熒光標(biāo)記后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法鑒定骨髓基質(zhì)干細(xì)胞純度。選用純化的大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，通過加入不同濃度丹參素、DKK-1抗體以及丹參素聯(lián)合DKK-1抗體等藥物作用后，觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶活性的變化、骨結(jié)節(jié)的形成，分析藥物對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響;提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)Dickkopf-1 mRNA與β-catenin

4、mRNA的表達(dá)，探討丹參素是否通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來影響大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化方向;通過檢測提取的細(xì)胞總蛋白中Dickkopf-1蛋白與β-catenin蛋白的表達(dá)量，進(jìn)一步驗(yàn)證丹參素影響骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化方向的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　通過傳代貼壁篩選的方法分離純化得到較為均一成纖維細(xì)胞型的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，取經(jīng)傳3代的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原CD45、CD90雙熒光標(biāo)記，經(jīng)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示經(jīng)傳3代后細(xì)

5、胞純度基本可達(dá)到80％，已經(jīng)能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。分離培養(yǎng)所得的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，分別加入各個(gè)濃度丹參素、DKK-1抗體及聯(lián)合用藥，觀察藥物的作用。結(jié)果與對照組比較，濃度為5×10-6mol/L、5×10-7mol/L的丹參素，在第9天和第15天能升高骨髓基質(zhì)干細(xì)胞ALP的活性(P＜0.05);0.1mg/L的DKK-1抗體在第6天即能出現(xiàn)促進(jìn)BMSCs堿性磷酸酶分泌的作用;聯(lián)合用藥組促ALP作用更加明顯，且較丹參素持久(P＜0.01)。茜素

6、紅染色顯示，二者聯(lián)合用藥組促鈣化效果明顯，骨結(jié)節(jié)數(shù)量等均較空白組多，丹參素和DKK-1抗體也有促進(jìn)鈣化的效果，但聯(lián)合用藥組作用更為明顯。RT-PCR結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均能表達(dá)Dickkopf-1 mRNA與β-catenin mRNA。其中5×10-6mol/L丹參素聯(lián)合0.1mg/L DKK-1抗體組和DKK-1抗體組Dickkopf-1mRNA較對照組表達(dá)明顯降低，其它給藥組表達(dá)量也有不同程度的降低，而β-catenin mRNA的

7、結(jié)果正好相反。Western Blot結(jié)果表明，各組細(xì)胞均有Dickkopf-1和β-catenin蛋白表達(dá)，單獨(dú)應(yīng)用DKK-1抗體組和聯(lián)合用藥組Dickkopf-1蛋白表達(dá)較空白對照組明顯減少，而β-catenin表達(dá)則較對照組增多。
　　結(jié)論:
　　丹參素與DKK-1抗體均有不同程度的促進(jìn)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖，增加BMSCs的堿性磷酸酶活性，促進(jìn)骨結(jié)節(jié)形成，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化的作用。通過對比已知的Wnt/β-cate