丹參素與丹酚酸B對骨髓基質干細胞成脂分化和成骨分化過程的Wnt-β-catenin通路的影響及其抗骨質疏松機制的探討.pdf

1、目的：
　　 本課題組的前期實驗證明了丹參水提物能有效地防治糖皮質激素引起的大鼠骨丟失;體外實驗觀察到丹參水提物對糖皮質激素誘導的骨髓基質干細胞的成脂分化能力有抑制作用,并能提高骨髓基質干細胞表達堿性磷酸酶的活性,刺激骨鈣素的分泌。但對其作用機制不明確。Wnt/β-catenin通路影響骨髓基質干細胞的增殖、遷移,并調控其分化方向?；罨疻nt/β-catenin途徑能促進骨髓基質干細胞向成骨細胞分化,抑制脂肪細胞的分化與成熟。因

2、此,本研究通過觀察丹參水提物的主要有效成份丹參素與丹酚酸B對體外大鼠骨髓基質干細胞(Marrowstromal stem cells,MSCs)成脂分化與成骨分化能力的影響,以探討丹參素與丹酚酸B對骨髓基質干細胞的分化方向的調節(jié)作用;通過觀察丹參素與丹酚酸B對骨髓基質干細胞成骨分化過程中的關鍵基因Runx2,成脂分化過程的關鍵基因過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ),以及調控骨髓基質干細胞的分化方向的Wnt/β-catenin信號通

3、路中的Dickkopf-1,β-catenin基因的影響,以探討丹參水提物丹參素與丹酚酸B對骨髓基質干細胞分化方向調控的作用機制。為中藥丹參作為抗骨質疏松的新作用提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 1大鼠骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)及成骨與成脂分化的鑒定
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化骨髓基質干細胞。應用油紅染色法判斷是否成功誘導骨髓基質干細胞向脂肪細胞方向分化。應用堿性磷酸酶染色法與茜素紅染色法判斷否成功誘導骨

4、髓基質干細胞向成骨細胞方向分化,并以此鑒定分離純化的骨髓基質細胞中是否含有干細胞成分。
　　 2丹參素與丹酚酸B對大鼠骨髓基質干細胞向成骨細胞與脂肪細胞分化方向的影響
　　 觀察不同濃度的丹參素與丹酚酸B對骨髓基質干細胞成脂分化率及過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)mRNA的影響,判斷藥物對骨髓基質干細胞成脂分化能力的影響。檢測堿性磷酸酶的活性以及Runx2mRNA的表達以判斷藥物對骨髓基質干細胞成骨分化能力的影響

5、。并觀察丹參素與丹酚酸B作用的量效關系和找出它們在實驗中的最佳作用濃度。
　　 3大鼠骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)在成骨與成脂分化誘導下的Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化骨髓基質干細胞,分別進行成脂誘導與成骨誘導。應用Wnt信號通路PCR芯片檢測骨髓基質干細胞在成脂分化與成骨分化誘導后Wnt信號途徑相關基因表達,以分析和尋找與骨髓基質干細胞定向分化相關的靶基因。
　　 4丹

6、參素與丹酚酸B對調控大鼠骨髓基質干細胞分化的Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因Dickkopf-1與p-catenin的影響
　　 選用純化的大鼠骨髓基質干細胞,把細胞分成:陰性對照組、成脂誘導組、成骨誘導組、成脂誘導+丹參素組、成脂誘導+丹酚酸B組,丹參素組,丹酚酸B組,藥物作用后檢測細胞Dickkopf-1mRNA與β-catenin mRNA的表達。探討丹參素與丹酚酸B是否通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號通路

7、影響大鼠骨髓基質干細胞分化方向。
　　 結果：
　　 1大鼠骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)及成骨與成脂分化的鑒定
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化得到較為均一成纖維細胞型的骨髓基質細胞。成骨誘導7后天堿性磷酸酶染色呈陽性,55天后骨結節(jié)茜素紅染色呈陽性;成脂誘導后出現(xiàn)個體增大的脂肪細胞,其脂滴可被油紅O染為紅色。說明分離的細胞具有干細胞特性,并能被定向誘導分化為成骨細胞和脂肪細胞,可用于檢測藥物的作用。
　　

8、 2丹參素與丹酚酸B對大鼠骨髓基質干細胞向成骨細胞與脂肪細胞分化的影響:
　　 骨髓基質干細胞用成骨誘導劑干預后堿性磷酸酶的表達較未誘導組明顯增加(p＜0.01)。成骨分化的關鍵基因Runx2mRNA表達也較未誘導組明顯增多。丹參素各個濃度在3天時無促進細胞表達堿性磷酸酶的作用。濃度為5×10-6mol/L,5×10-7mol/L的丹參素與正常對照組相比,在第5天,7天能升高ALP的活性(P＜0.05)。丹酚酸B濃度為10-6m

9、ol/L與10-7mol/L時有促進骨髓基質干細胞分泌堿性磷酸酶的作用,該作用在藥物作用第三天時出現(xiàn),第5天和第7天時最明顯(P＜0.05)。濃度為5×10-7mol/L丹參素與濃度為10-7mol/L丹酚酸B與正常對照組組相比,均能增加Runx2mRNA的表達,以丹參素作用明顯。添加脂肪誘導劑后rMSCs分化為脂肪細胞的能力比正常對照組明顯加強。油紅染色化學比色值(p＜0.01)及PPARγmRNA的表達較正常對照組明顯增加。成脂誘導

10、加藥組的成脂分化率比脂肪誘導組減少但差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但隨著時間的延長比色值并未明顯增加。濃度為5×10-7mol/L丹參素與濃度為10-7mol/L丹酚酸B均能減少PPARγmRNA的表達,以丹參素作用明顯。
　　 3大鼠骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)在成骨與成脂分化誘導下的Wnt/β-catenin信號通路的調節(jié)
　　 通過傳代貼壁篩選的方法分離純化得到較為均一骨髓基質干細胞。經(jīng)誘導后可向成骨細胞和脂肪細胞方

11、向分化。在Wnt信號通路89個相關基因中,與未誘導組相比,骨髓基質干細胞成脂誘導后Wnt信號通路表達上調的基因(Dkk-1、kremen、Fzd1)等15個(ratio＞2),下調的基因(sFrp5,β-catenin,Dvl3,Tct7)等16個(ratio＜0.5)。成骨誘導后Wnt信號通路表達上調的基因(Dkk1,kremen,β-catenin,Wnt11)6個(ratio＞2),表達下調的基因(sFrp5,sFRP4,Fzdl

12、)等15個(ratio＜0.5)。
　　 4丹參素與丹酚酸B對調控大鼠骨髓基質干細胞分化的Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因Dickkopf-1mRNA與β-cateninmRNA的影響。
　　 對照組、誘導組、和給藥組的大鼠骨髓基質干細胞均能表達Dickkopf-1與β-catenin mRNA。其中脂肪誘導組Dickkopf-1表達較對照組明顯增高,β-catenin則較對照組明顯下降。成骨誘導組則相反:Di

13、ckkopf-1較對照組表達明顯降低,β-catenin則較對照組明顯增多。脂肪誘導+丹參素組、脂肪誘導+丹酚酸B組的Dickkopf-1表達均比脂肪誘導組明顯減少,而β-catenin則比脂肪誘導組明顯增多。丹參素組、丹酚酸B組表達的Dickkopf-1比正常組少,同時丹參素組β-catenin的表達比正常組多,但丹酚酸B組β-catenin的表達比正常組少。
　　 結論：
　　 1丹參素與丹酚酸B均可促進大鼠骨髓基質

14、干細胞向成骨細胞分化,增加MSCs的堿性磷酸酶活性,增加成骨分化關鍵基因Runx2mRNA的表達。丹參素和丹酚酸B同時使脂肪分化的關鍵基因PPARγmRNA表達減少,能使脂肪細胞脂滴減少。但不能減少脂肪細胞的數(shù)目。
　　 2大鼠骨髓基質干細胞在成骨分化與成脂分化過程中主要影響Wnt/β-catenin信號通路中的Dickkopf-1基因。
　　 3丹參素通過減少Wnt/β-catenin信號通路中的Dickkopf-1m