位點不依賴性乳腺表達載體的構(gòu)建及在乳腺上皮細胞中的表達.pdf

1、本文旨在建立位點不依賴性乳腺特異性表達載體，以克服轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中因位置效應(yīng)影響而導致的表達效率低下的問題。同時通過對內(nèi)源性β-酪蛋白表達與否的檢測來篩選出有泌乳功能的乳腺上皮細胞體系，在細胞水平對所構(gòu)建的乳腺特異性表達載體的合理性、有效性進行檢測。 引進含有隔離子序列的pWHERE2v.01質(zhì)粒，對pWHERE2v.01質(zhì)粒進行改造，去除隔離子序列間的LacZ基因序列，將回收的片段修飾環(huán)化得到新的質(zhì)粒pWHERE-1(6844

2、bp)。將目的蛋白BLG-VP2分離，定向克隆入改造后pWHERE-1質(zhì)粒的兩個隔離子序列之間，構(gòu)建成pW-BLG-VP2位點不依賴性乳腺表達載體。 從泌乳期山羊乳腺組織分離得到山羊乳腺上皮細胞體系GMEC，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和免疫組化方法對GMEC細胞中β-酪蛋白表達與否進行檢測以評價GMEC乳蛋白合成的功能。同時，比較商品化小鼠乳腺癌細胞C127、人乳腺癌細胞系T47D中β-酪蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達。