轉(zhuǎn)錄因子_5Stat5a對乳腺上皮細(xì)胞微小RNA(microRNA)表達(dá)的影響.pdf

1、Stat5a在不同類型的細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，是調(diào)控女性生殖系統(tǒng)如乳腺等發(fā)育的最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，影響細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其異常表達(dá)或變異與人類生殖系統(tǒng)癌癥如乳腺癌、前列腺癌等有一定的關(guān)系。?5 Stat5a是從人乳腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，由轉(zhuǎn)錄后FL Stat5a hnRNA選擇性剪接生成的變體，缺失了位于 N-末端的與第5號外顯子對應(yīng)的30個氨基酸。我們推測，其結(jié)構(gòu)變異可能引起其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，從而導(dǎo)

2、致乳腺上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。該變體的發(fā)現(xiàn)和研究對進(jìn)一步認(rèn)識人類乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)理和臨床治療有非常重要的價值。
　　本研究通過構(gòu)建分別攜帶 FL Stat5a和?5 Stat5a cDNA的 pLVX-FL和pLVX-Δ5慢病毒表達(dá)載體，以pLVX-AcGFP1-N1空載體作為對照，分別轉(zhuǎn)染人胚腎HEK293T細(xì)胞，包裝獲得高滴度有活性的病毒，然后以此病毒感染人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7），經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得MCF7-Con、MC

3、F7-FL和MCF7-Δ5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。分別培養(yǎng)上述三種穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，提取其總RNA，然后以Illumina HiSeqTM2500高通量測序平臺對sRNA進(jìn)行深度測序。統(tǒng)計(jì)各樣品中人源的2588種miRNA的表達(dá)量并計(jì)算校正表達(dá)值（RPM值），比較每兩組樣品之間的 miRNA表達(dá)的差異性，對樣品中的新 miRNA進(jìn)行預(yù)測和二級結(jié)構(gòu)及序列分析，探討過表達(dá) FL Stat5a和Δ5 Stat5a對人乳腺癌細(xì)胞miRNA表達(dá)的影響。
　　測

4、序統(tǒng)計(jì)分析表明，過表達(dá)FL Stat5a和Δ5 Stat5a使sRNA表達(dá)譜及其豐度發(fā)生改變，相對于MCF7-Con細(xì)胞，表達(dá)水平變化較大的sRNA主要位于1、3、6、7、11、12號染色體，其他染色體sRNA表達(dá)水平變化較??；
　　MCF7-Con、MCF7-FL和 MCF7-Δ5中分別有595、506和526種miRNA表達(dá)，且60％以上的miRNA表達(dá)量在1~100之間；
　　21個僅在MCF7-Δ5中表達(dá)，17個在M

5、CF7-Δ5中不表達(dá)，但在MCF7-Con及MCF7-FL有表達(dá)；11個在MCF7-FL中表達(dá)，17個在MCF7-FL中不表達(dá)，但在MCF7-Con及MCF7-Δ5表達(dá)；
　　相對于 MCF7-Con，MCF7-FL穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中298個 miRNA表達(dá)具有差異（19個為一般顯著性差異，5個表達(dá)上調(diào)，14個表達(dá)下調(diào)，31個為極顯著性差異，11個表達(dá)上調(diào)，20個表達(dá)下調(diào)），相對于MCF7-Con，MCF7-Δ5中324個 miRNA表達(dá)

6、具有差異（22個為一般顯著性差異，6個表達(dá)上調(diào)，16個表達(dá)下調(diào)，28個為極顯著差異，7個表達(dá)上調(diào)，21個表達(dá)下調(diào)），相對于MCF7-FL，MCF7-Δ5中有106個miRNA表達(dá)具有差異（4個為一般顯著性差異，均為表達(dá)下調(diào)，99個為極顯著差異，50個表達(dá)上調(diào)，49個表達(dá)下調(diào)）；
　　分別預(yù)測到110、91、105種可能的miRNA，其中分別有27、27和25種位于基因組的基因間區(qū)且具有已知miRNA的類似結(jié)構(gòu)。
　　FL S

7、tat5a和?5 Stat5a過表達(dá)可顯著影響細(xì)胞miRNA的表達(dá)，二者之間存在顯著性差異；在MCF7-Δ5細(xì)胞不表達(dá)，但在MCF7-Con及MCF7-FL有表達(dá)的17種miRNA需要進(jìn)一步深入研究，特別是 hsa-miR-873-3p和 hsa-miR-216b-5p（與MCF7-Con組具有顯著性差異）；hsa-miR-873-3p、miR-486-5p、miR-338-5p（表達(dá)量三組樣品中兩兩具有顯著性差異）將是我們下一步的研究

8、重點(diǎn)；過表達(dá)Δ5 Stat5a抑制hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-335-3p、hsa-miR-429等53個miRNA表達(dá)，促進(jìn)hsa-miR-218-5p、hsa-miR-34a-3p、hsa-miR-155-5p等50個miRNA表達(dá)，說明Δ5 Stat5a可能通過調(diào)節(jié)這些miRNA的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移，反之，miRNA的表達(dá)變化也可以反向調(diào)節(jié)Δ5 Stat5a的表達(dá)。

9、
　　本研究對進(jìn)一步研究Δ5 Stat5a在乳腺癌發(fā)生與發(fā)展中的分子機(jī)理有重要意義，已有確切證據(jù)表明 hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-218-5p、hsa-miR-34a-3p等miRNA在乳腺癌的發(fā)生或治療中發(fā)揮作用，hsa-miR-3922-5p、hsa-miR-5585-3p、hsa-miR-6784-3p、hsa-miR-659-5p、hsa-miR-1261等多種miRNA與