c-Jun-ATF2二聚體在神經(jīng)元凋亡中的作用.pdf

1、神經(jīng)元凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，而且越來越多的證據(jù)表明神經(jīng)元凋亡是形成神經(jīng)退行性疾病的機制之一。因此，闡明神經(jīng)元凋亡機制對于發(fā)現(xiàn)神經(jīng)性疾病病因和明確治療靶點有非常重要的意義。 小腦顆粒神經(jīng)元(CGNs)是哺乳動物腦中豐富的中樞神經(jīng)元。體外培養(yǎng)CGNs時，胞外25mM KCl(高鉀)可使神經(jīng)元處于去極化狀態(tài)，維持小腦顆粒神經(jīng)元的分化、成熟和存活，而去血清、復(fù)極化濃度的KCl(5mM，低鉀)培養(yǎng)基可誘導(dǎo)分化成熟的

2、小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。由于小腦顆粒神經(jīng)元來源豐富、體外培養(yǎng)的同質(zhì)性高，所以此凋亡模型已被廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)元凋亡機制的研究。 大量研究表明，JNK/c-Jun通路的激活在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。低鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元、撤NGF處理的交感神經(jīng)元、D淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元等凋亡模型中，都已證明JNK的活化是凋亡發(fā)生所必需的。c-Jun與ATF2作為JNK重要的下游底物，其活性也伴隨磷酸化水平的升高而升高，目前的研究表明，

3、c-Jun與ATF2可以形成轉(zhuǎn)錄因子二聚體作用于下游的靶基因，從而發(fā)揮促凋亡作用。 c-jun作為AP1蛋白家族需要與其它bZIP結(jié)構(gòu)蛋白形成二聚體才能發(fā)揮完整的轉(zhuǎn)錄因子功能，而且一直以來圍繞著凋亡下游的靶基因是什么，尤其是c．iun這個與凋亡關(guān)系比較密切的轉(zhuǎn)錄因子的靶基因是什么的問題是近幾年國內(nèi)外研究的熱點。然而在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡中，c-Jun與ATF2是否形成了二聚體并沒有相關(guān)文獻予以直接回答，而二者與凋亡之間的

4、關(guān)系也沒有明確的報道。如果我們能證實在低鉀誘導(dǎo)的CGNs凋亡中，c-Jun/ATF2二聚體確實形成并參與了凋亡進程，那么對于以c-Jun/ATF2轉(zhuǎn)錄因子二聚體為出發(fā)點來尋找下游靶基因具有重要的指導(dǎo)意義。因此，本課題主要探討以下幾個問題： 1．在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2活性是否增加； 2．在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2是否形成了二聚體； 3．c-Jun與ATF2

5、二聚體的形成是否是神經(jīng)元凋亡所必須的。 結(jié)果 1．低鉀(5mM KCl)誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型時c-Jun與ATF2的活性變化小腦顆粒神經(jīng)元體外培養(yǎng)第7天，分別用25mM KCl(25K)或5mM KCl(5K)培養(yǎng)基處理0.5、1、2、4h。收集蛋白后用Western Blot方法檢測發(fā)現(xiàn)，低鉀處理時，ATF2的69與71位蘇氨酸磷酸化水平從0.5h開始增加，2h達到峰值，然后逐漸下降，而ATF2的轉(zhuǎn)錄活性增強，是

6、69/71位蘇氨酸磷酸化依賴的；同時我們用c-Jun磷酸化抗體(Ser73)檢測c-Jun磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)c-Jun磷酸化水平在低鉀0.5h后同樣顯著增加，2h達到最高，c-Jun Ser63，Ser73位點的磷酸化同樣能增加c-Jun轉(zhuǎn)錄活性。這說明神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2的磷酸化水平增加，轉(zhuǎn)錄活性增加。 2．低鉀(5mM KCl)誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡模型時c-Jun與ATF2形成二聚體c-Jun與ATF2同

7、屬于堿性-亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper，bZip)蛋白成員，已有的研究表明，c-Jun與ATF2可以形成二聚體并且特異性與ATF/CRE序列(TTACCTCA或TGACGTCA，下稱ATF序列)結(jié)合。為此，我們用ATF序列為探針進行了EMSA分析，以獲得低鉀誘導(dǎo)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時c-Jun與ATF2形成二聚體的證據(jù)。體外培養(yǎng)第7天的神經(jīng)元分別用25K、5K處理4h，然后收集核蛋白，與γ<'32>p標記的ATF探

8、針孵育后跑膠，干膠后放射自顯影。發(fā)現(xiàn)ATF探針與核蛋白形成復(fù)合物，并且此復(fù)合物在5 K處理增加。進一步超飄移實驗(supershift assay)來證明復(fù)合物中的組分。探針核蛋白孵育時加入c-Jun抗體，發(fā)現(xiàn)ATF位點特異復(fù)合物明顯減少，而在上方出現(xiàn)了一新條帶(supershifted band)，表明c-Jun為復(fù)合物組分之一。加入ATF2抗體后發(fā)現(xiàn)，特異條件減弱，顯示ATF2抗體可干預(yù)特異復(fù)合物的形成，表明ATF2也存在蛋白復(fù)合物

9、中。我們的結(jié)果顯示c-Jun與ATF2都存在結(jié)合ATF位點的蛋白質(zhì)復(fù)合物中，強烈提示兩者作互作用形成復(fù)合體。 3．小分子干擾c-Jun或ATF2對小腦顆粒神經(jīng)元凋亡和存活的干預(yù)作用體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀法共轉(zhuǎn)染shc-Jun-a，shc-Jun-b或空質(zhì)粒BS/U6，pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于標記轉(zhuǎn)染成功的細胞。48h后，換成25K、5K模型。12h后Hoechst 33258(5 g/ml)進行染色顯示細胞

10、核形態(tài)用于計數(shù)凋亡細胞(細胞核固縮或細胞核碎裂)，GFP陽性細胞數(shù)計為總數(shù)，計算凋亡率。結(jié)果顯示干擾c-Jun表達后神經(jīng)元凋亡率大大下降，同樣的沉默ATF2也具有保護性干預(yù)作用。 4．P12×jun2 decoy質(zhì)粒對小腦顆粒神經(jīng)元凋亡和存活的干預(yù)作用體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀法共轉(zhuǎn)染P12×jun2，P12×jun2-mut或空質(zhì)粒pMD，pEGFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染用于標記轉(zhuǎn)染成功的細胞。36h后，換成25K、5K模

11、型。12h后Hoechst 33258(5 ug/ml)進行染色顯示細胞核形態(tài)用于計數(shù)凋亡細胞(細胞核固縮或細胞核碎裂)，GFP陽性細胞數(shù)計為總數(shù)，計算凋亡率。結(jié)果顯示P12×jun2組顯著的降低5K下的神經(jīng)元凋亡率，說明P12×jun2decoy質(zhì)粒能有效的保護低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡。 結(jié)論： 1．在低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡時，c-Jun與ATF2轉(zhuǎn)錄活性增加。 2．轉(zhuǎn)錄因子c-Jun與ATF2在低鉀