鷹嘴豆芽素A對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：阿爾茨海默病（Alzheimer’sdisease，AD），以其發(fā)現(xiàn)者（AloisAlzheimer）命名的，是一種主要影響老年人的神經(jīng)退行性疾病，其特點(diǎn)是逐步惡化的記憶、認(rèn)知和行為，是世界范圍內(nèi)造成癡呆的主要原因，據(jù)估計(jì)，到2050年將有1.154億人罹患AD。β-淀粉樣肽（β-amyloid，Aβ）沉積是大多數(shù)學(xué)者認(rèn)可的AD發(fā)病機(jī)制之一。Aβ通過(guò)引起線粒體功能損傷，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和鈣離子超載，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放和半胱胺酸天

2、冬氨酸蛋白酶的活化，從而啟動(dòng)神經(jīng)元的凋亡。鷹嘴豆芽素A（BiochaninA），是甲基化的天然異黃酮類化合物，屬于植物雌激素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等性質(zhì)。研究顯示，鷹嘴豆芽素A對(duì)單方面注入脂多糖誘導(dǎo)的帕金森大鼠模型具有保護(hù)作用，在腦缺血再灌注模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，然而鷹嘴豆芽素A對(duì)AD模型中神經(jīng)損傷的保護(hù)作用研究較少，機(jī)制尚不明確。本研究采用Aβ活性片斷Aβ25-35建立AD細(xì)胞模型、AD大鼠模型，檢測(cè)BiochaninA對(duì)AD模

3、型下的神經(jīng)元及大鼠的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討B(tài)iochaninA神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。
　　方法：
　　1、大鼠大腦皮質(zhì)原代神經(jīng)元培養(yǎng)
　　取新生24h內(nèi)SD大鼠，無(wú)菌條件下取腦皮質(zhì)部分，經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞懸液，過(guò)濾后接種于用多聚賴氨酸預(yù)先包被的培養(yǎng)板中，置于5％CO2及飽和濕度的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后首次換液為含2%B27的neurobasal完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后半量換液為含有阿糖胞苷的neurobasa

4、l完全培養(yǎng)基，48h后完全換液去除阿糖胞苷，以后每隔2d半量換液。神經(jīng)元培養(yǎng)七天即可用于實(shí)驗(yàn)。
　　2、AD大鼠模型的制備
　　大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，將其固定于腦立體定位儀，沿顱骨中線切開(kāi)皮膚，暴露出前囟位置。參考圖譜中所描述的海馬CA1區(qū)位置，根據(jù)動(dòng)物實(shí)際大小稍作調(diào)整，距前囟向后3.5mm，距中線左右各2.0mm處，開(kāi)直徑為1mm的骨窗，微量注射器垂直顱骨表面進(jìn)針3.5mm，緩慢注入5μLAβ25-35溶液，

5、留針10min，緩慢撤針，縫合。
　　3、凝聚態(tài)Aβ25-35的制備
　　在無(wú)菌條件下將2mgAβ25-35粉末溶解于1ml滅菌注射用水中，分裝后在37℃放置72h使其老化后，將其儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用。
　　4、實(shí)驗(yàn)分組與給藥
　　4.1Aβ25-35損傷大鼠神經(jīng)元細(xì)胞模型的制備
　　新生1d內(nèi)的SD大鼠，取皮層部位進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后（7d），經(jīng)Aβ25-35處理，隨機(jī)分為control

6、組、Aβ25-35組（Aβ25-35濃度分別為10、20、40μM），處理24h，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　4.2鷹嘴豆芽素A對(duì)神經(jīng)元存活率的影響
　　新生1d內(nèi)SD乳鼠，取皮層部位進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至神經(jīng)元成熟以后，經(jīng)BiochaninA處理，隨機(jī)分為control組、BiochaninA組（BiochaninA濃度分別為0.5、1、2.5、5、10、20μM），處理24h，檢測(cè)細(xì)胞的存活率。
　　4.3鷹嘴豆芽素A對(duì)

7、Aβ25-35所致神經(jīng)元損傷的影響
　　培養(yǎng)7d的皮層神經(jīng)元，隨機(jī)分組后分別加入不同濃度BiochaninA（0.2、1、5、10μM）與Aβ25-35（20μM），BiochaninA加入6h后加入Aβ25-35，處理24h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　4.4Aβ25-35對(duì)SD大鼠行為學(xué)的影響
　　將30只體重180-200g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為3組（假手術(shù)組、溶劑對(duì)照組（假手術(shù)+蒸餾

8、水）、以及Aβ25-35損傷組），每組10只。術(shù)后7d-12d進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試。
　　4.5鷹嘴豆芽素A對(duì)Aβ25-35損傷大鼠行為學(xué)的影響
　　將70只體重180-200g雄性Spague-Dawley（SD）大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組、模型組、溶劑對(duì)照組、低濃度組（模型組+10mg/kg）、中濃度組（模型組+20mg/kg）、高濃度組（模型組+40mg/kg）、雌二醇對(duì)照組（模型組+雌二醇）。模型制備方法

9、同第一部分，BiochaninA保護(hù)組于術(shù)后2周腹腔注射不同劑量的BiochaninA。溶劑對(duì)照組大鼠注射與高濃度組等體積的DMSO。BiochaninA注射2周后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。4.6雌激素受體抑制劑對(duì)鷹嘴豆芽素A的神經(jīng)保護(hù)作用的影響
　　取培養(yǎng)7d的神經(jīng)元細(xì)胞，隨機(jī)分為control組、Aβ25-35（20μM）組、BiochaninA保護(hù)組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）、雌激素受體抑制劑阻斷Bioch

10、aninA組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA+10μMICI182780）、E2保護(hù)組（20μMAβ25-35+100nME2）、雌激素受體抑制劑阻斷E2組（20μMAβ25-35+100nME2+10μMICI182780）。采用Westernblot法觀察雌激素受體抑制劑（ICI182780）干預(yù)BiochaninA對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元caspase-3表達(dá)水平的影響。
　　4.7鷹嘴豆芽素A對(duì)神經(jīng)

11、元內(nèi)MAPK家族蛋白的影響
　　取培養(yǎng)7d的神經(jīng)元細(xì)胞，隨機(jī)分為control組、Aβ25-35（20μM）組、BiochaninA保護(hù)組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）。采用Westernblot法觀察BiochaninA對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元MAPK家族蛋白表達(dá)水平的影響。
　　4.8鷹嘴豆芽素A及p38MAPK抑制劑SB202190對(duì)凋亡蛋白家族的caspase-3、Bcl-2、Bax、gr

12、p78及p38通路的影響
　　取培養(yǎng)7d的神經(jīng)元細(xì)胞，隨機(jī)分為control組、Aβ25-35（20μM）組、BiochaninA保護(hù)組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）、p38MAPK抑制劑阻斷組（20μMAβ25-35+10μMSB202190）、p38MAPK抑制劑組（10μMSB202190）、雌二醇保護(hù)組（20μMAβ25-35+100nME2）。采用Westernblot法觀察p38MAPK抑制劑（

13、SB202190）對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78、P-p38、ATF2表達(dá)水平的影響。
　　5、MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率
　　細(xì)胞接種于24孔板，加藥處理24h后，每孔加入20μLMTT液（3.6mmol·L-1），37℃孵育4h，棄上清，加入500μLDMSO，使甲瓚結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光度值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。
　　6、WesternBlot分析
　

14、　取分組加藥處理后神經(jīng)元細(xì)胞，冰上操作，提取細(xì)胞蛋白，蛋白提取液與上樣緩沖液混合，煮沸變性。SDS-PAGE電泳使蛋白樣品分離，100mA恒流轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉2h以上，一抗4℃過(guò)夜，TBST漂洗30min后加二抗室溫孵育2h，TBST漂洗30min，暗盒中加ECL發(fā)光試劑顯色，暗室中壓X光片顯影。X-光膠片經(jīng)掃描，應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件對(duì)掃描圖上的條帶進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　7、Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試
　　

15、提前1h將SD大鼠放置于行為學(xué)測(cè)試房間內(nèi)，使其適應(yīng)環(huán)境。行為學(xué)測(cè)試于每天9:30開(kāi)始，室溫25℃，水溫20℃-22℃，Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試歷時(shí)6天，前5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每天訓(xùn)練4次。大鼠入水至尋找到平臺(tái)所需時(shí)間為逃避潛伏期（escapelatency）。第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，將大鼠從與平臺(tái)所在象限相對(duì)的象限面壁放入水中，記錄大鼠90s內(nèi)穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù)（numberofplatformcrossings）以及大鼠在

16、平臺(tái)所屬象限（第一象限）停留的時(shí)間百分比（Ⅰtimeratio）等行為學(xué)指標(biāo)。
　　8、數(shù)據(jù)處理
　　上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，所有數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用單因素方差分析（onewayANOVA）繼以student’sttest對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、BiochaninA對(duì)Aβ25-35所致原代培養(yǎng)皮質(zhì)

17、神經(jīng)元損傷的作用
　　1.1Aβ25-35建立AD細(xì)胞模型
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，10、20、40μmol/LAβ25-35作用于大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元24h后均可致神經(jīng)元細(xì)胞的存活率降低，而20μMAβ25-35作用24h后，細(xì)胞的存活率為溶劑對(duì)照組的（62.55±0.01）%（P＜0.05）在上述濃度范圍內(nèi)，根據(jù)Aβ25-35的毒性，選擇20μmol/LAβ25-35處理24h建立AD細(xì)胞模型。
　　

18、1.2BiochaninA對(duì)神經(jīng)元存活率的影響
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，0.5、1、2.5、5、10、20μmol/L的鷹嘴豆芽素A作用于大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元24h后細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯變化。
　　1.3BiochaninA對(duì)Aβ25-35所致神經(jīng)元損傷的作用
　　MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1μmol/L鷹嘴豆芽素A對(duì)Aβ25-35處理24h后，顯示出最大的保護(hù)作用，其存活率為Aβ25-35損傷組

19、組的125.8%（P＜0.05）。
　　2、BiochaninA對(duì)AD大鼠模型的影響
　　2.1Aβ25-35對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)期間每一組大鼠的逃避潛伏期全部隨學(xué)習(xí)天數(shù)的逐漸增加而縮短；三組大鼠每天平均游泳速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；相比于溶劑對(duì)照組大鼠，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05），而假手術(shù)組大鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)與溶劑對(duì)照組大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　空間

20、探索實(shí)驗(yàn)期間假手術(shù)組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù)與溶劑對(duì)照組大鼠無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，假手術(shù)組大鼠與溶劑對(duì)照組大鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與溶劑對(duì)照組相比，Aβ25-35組大鼠穿越平臺(tái)區(qū)的次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。與溶劑對(duì)照組相比，Aβ25-35組大鼠在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比顯著減少（P＜0.05）。
　　2.2BiochaninA對(duì)Aβ25-35損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響
　　Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示

21、，定位航行實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠的逃避潛伏期全部隨學(xué)習(xí)天數(shù)的增加而逐漸縮短；七組大鼠每天平均游速無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；相比于溶劑對(duì)照組，雌二醇組部分逆轉(zhuǎn)Aβ25-35損傷引起的逃避潛伏期增加，鷹嘴豆芽素A能夠改善Aβ25-35損傷引起的逃避潛伏期增加，且作用呈濃度依賴性?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鷹嘴豆芽素A能夠改善Aβ25-35損傷大鼠平臺(tái)區(qū)穿越次數(shù)減少及在平臺(tái)所在象限停留時(shí)間百分比減少的現(xiàn)象，且作用呈濃度依賴性。
　　3、雌激素受體抑制劑對(duì)Bi

22、ochaninA的神經(jīng)保護(hù)作用的影響
　　Westernblot結(jié)果顯示，與鷹嘴豆芽素A保護(hù)組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA）相比ICI182780處理組（20μMAβ25-35+1μMBiochaninA+ICI182780）caspase-3蛋白水平明顯增加（P＜0.05）。
　　4、BiochaninA對(duì)神經(jīng)元內(nèi)MAPK家族蛋白的影響
　　Westernblot結(jié)果顯示，與control組相

23、比Aβ25-35損傷組P-JNK、P-p38的表達(dá)增加，P-ERK的表達(dá)降低（P＜0.05）。與Aβ25-35損傷組相比，鷹嘴豆芽素A保護(hù)組P-p38蛋白水平降低（P＜0.05），而P-JNK、P-ERK沒(méi)有明顯變化。
　　5、BiochaninA及p38MAPK抑制劑SB202190對(duì)凋亡蛋白家族的caspase-3、Bcl-2、Bax、grp78以及p38信號(hào)通路的影響
　　Westernblot結(jié)果顯示，與Aβ25-3

24、5損傷組相比，鷹嘴豆芽素A保護(hù)組與p38MAPK抑制劑處理組caspase-3蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。與Aβ25-35損傷組相比，鷹嘴豆芽素A保護(hù)組與p38MAPK抑制劑處理組Bax/Bcl-2比值明顯降低（P＜0.05）。
　　Westernblot結(jié)果顯示，與Aβ25-35組相比，鷹嘴豆芽素A組與p38MAPK抑制劑處理組P-p38、ATF2蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。與control組相比，Aβ25-35損傷

25、組grp78蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。鷹嘴豆芽素A保護(hù)組能明顯抑制Aβ25-35引起的grp78蛋白水平升高（P＜0.05）。Aβ25-35+SB202190組與單加SB202190組grp78蛋白水平與Aβ25-35組相比沒(méi)有明顯降低。
　　結(jié)論：
　　1、BiochaninA能對(duì)抗Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，對(duì)Aβ25-35損傷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶具有改善作用。
　　2、BiochaninA能對(duì)抗Aβ25-