MRTF-A保護Aβ25-35誘導(dǎo)突觸損傷的作用及機制研究.pdf

1、目的:
　　研究MRTF-A對Aβ25-35誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷的保護作用及其機制。
　　方法:
　　1.MRTF-A對Aβ25-35誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷及其對神經(jīng)絲蛋白、MRTF-A、CaMKⅡ表達的影響:Aβ25-35腦室注射(AP:-3.8mm, ML:±3.0mm, DV:-3.2mm)誘導(dǎo)制備阿爾茨海默癥大鼠模型,用Morris水迷宮對大鼠行為學(xué)進行檢測。采用免疫組化和免疫熒光觀察大鼠腦神經(jīng)絲蛋白、MRTF-A、

2、CaMKⅡ的表達。
　　2.MRTF-A對Aβ25-35誘導(dǎo)原代皮層細(xì)胞突觸形態(tài)及神經(jīng)絲蛋白表達的影響:將原代皮層細(xì)胞分成control組、Aβ25-35處理組、MRTF-A轉(zhuǎn)染組。用免疫熒光標(biāo)記神經(jīng)絲蛋白,在激光共聚焦觀察皮層細(xì)胞突觸形態(tài)及神經(jīng)絲蛋白表達。
　　3.MRTF-A對Arc(Activity-regulated cytoskeletal-associated protein)表達的影響:將原代皮層細(xì)胞分成Con

3、trol組、Aβ25-35處理組、MRTF-A轉(zhuǎn)染組。用RT-PCR和Western blot法分別從mRNA和蛋白水平檢測Arc表達。
　　4.MRTF-A對Arc啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響:轉(zhuǎn)染MRTF-A(0.2μg)至皮層細(xì)胞,分別共轉(zhuǎn)報告基因Arc luciferase reporter或其突變體DN-Arc luciferase reporter質(zhì)粒,用Luciferase reporter法檢測Arc luciferase

4、 reporter或DN-Arc luciferase reporter轉(zhuǎn)錄活性的變化。
　　5.MRTF-A上調(diào)Arc表達是否與CaMKⅡ有關(guān):轉(zhuǎn)染MRTF-A(0.2μg)至皮層細(xì)胞,并用CaMKⅡ選擇性抑制劑KN-62處理皮層細(xì)胞,用Western blot法檢測皮層細(xì)胞Arc蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.MRTF-A對Aβ25-35誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷及其對神經(jīng)絲蛋白、MRTF-A、CaMKⅡ表達的影響:大鼠行

5、為學(xué)結(jié)果表明,Aβ25-35腦室注射后大鼠無論是潛伏期還是游泳距離都顯著性升高,說明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降;大鼠腦組織切片顯示:Aβ25-35腦室注射后大鼠腦神經(jīng)元突觸嚴(yán)重丟失,神經(jīng)絲蛋白表達量下降;皮層、海馬區(qū)MRTF-A和CaMKⅡ的表達均明顯上升,具有一定的相關(guān)性。
　　2.MRTF-A對體外培養(yǎng)的原代皮層神經(jīng)元突觸可塑性的影響:MRTF-A能明顯上調(diào)神經(jīng)絲蛋白表達,降低Aβ25-35對突觸的損傷,保持突觸結(jié)構(gòu)的完整性;RT-

6、PCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示:MRTF-A可顯著性逆轉(zhuǎn)Aβ25-35對Arc表達的下調(diào)(p<0.05);Luc結(jié)果顯示,MRTF-A可顯著性上調(diào)Arc luciferase reporter的轉(zhuǎn)錄活性(p<0.05),但是對DN-Arc luciferase reporter的轉(zhuǎn)錄活性無上調(diào)作用。
　　3.MRTF-A上調(diào)Arc表達是否與CaMKⅡ有關(guān);Western blot檢測結(jié)果顯示,KN-62能顯著抑制M

7、RTF-A誘導(dǎo)Arc表達的作用,且存在劑量依賴性(p<0.05或p<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.Aβ25-35腦室注射誘導(dǎo)的AD大鼠,其學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降;而且大鼠腦組織中MRTF-A、CaMKⅡ的表達均明顯上升,提示MRTF-A、CaMKⅡ可能參與了AD的病理過程。
　　2.MRTF-A能明顯上調(diào)神經(jīng)絲蛋白表達,降低Aβ25-35對突觸的損傷,保持突觸結(jié)構(gòu)的完整性。MRTF-A通過作用Arc啟動子CArG b