異鉤藤堿對Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用.pdf

1、目的：觀察異鉤藤堿（Isorhynchophylline, IRN）對β-淀粉樣蛋白25-35（beta amyloid peptides25-35， Aβ25-35）損傷的大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(rat pheochromocytoma cell，PC12）凋亡的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：（1）接種傳代培養(yǎng)PC12細(xì)胞。（2）將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞分為正常對照(Control)組、模型（Model）

2、組以及6個濃度梯度的IRN組。其中IRN干預(yù)的各組先以不同濃度梯度的IRN作用于PC12細(xì)胞2h后，再與20μmol/L的Aβ25-35共孵育24h。CCK-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法檢測細(xì)胞存活率；結(jié)晶紫比色法測定細(xì)胞增殖率，篩選出3個IRN的干預(yù)濃度。（3）流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。（4）比色法檢測細(xì)胞丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dism

3、utase，SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）活力；2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）。（5）Rhodamine123熒光染色法檢測線粒體膜電位。（6）ELISA法檢測細(xì)胞腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。（7）Western blot法檢測

4、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine-containing aspartate specific proteases-3，Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 Associated X Protein

5、, Bax）及細(xì)胞色素C（Cytochrome C, Cyt C）的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）與Control組細(xì)胞存活率[(99.32±0.21)％]和增殖率[(99.56±0.42)%]相比， Model組細(xì)胞存活率[(51.01±2.24)%]和增殖率[(50.86±2.36)%]顯著降低（P<0.05）；與Model組相比，不同濃度梯度的IRN組細(xì)胞存活率[(55.62±2.70)%、(59.05±2.06)%、(76.03

6、±1.97)%、(66.26±1.41)%、(57.22±2.86)%、(52.32±2.65)%]和增殖率[(58.74±2.44)%、(76.22±1.86)%、(67.56±1.82)%]升高（P<0.05），其中20μmol/L IRN組升高最明顯。因此，將IRN的3個濃度分別確定為5μmol/L、20μmol/L和80μmol/L。（2）流式細(xì)胞結(jié)果顯示，與Control組細(xì)胞凋亡率[(2.50±1.02)%]比較， Mode

7、l組細(xì)胞凋亡率[(25.31±2.62)%]增高（P<0.05）；與Model組比較， IRN組 PC12細(xì)胞凋亡率[(23.10±1.52)%、(14.07±2.02)%、(22.67±1.12)%]下降（P<0.05）。（3）比色法檢測結(jié)果顯示，與 Control組SOD[(366.89±7.85)U/mg prot]、GSH-Px活力[(372.16±6.58)mU/mg]和MDA水平[(586.14±24.81)nmol/mg

8、prot]比較， Model組 SOD[(162.26±5.15)U/mg prot]、GSH-Px[(92.65±11.35)mU/mg]活力降低，MDA水平[(1343.42.49±26.42)nmol/mg prot]升高（P<0.05）；與Model組比較，IRN組PC12細(xì)胞SOD[(195.11±18.26)U/mg prot、(296.64±4.12)U/mg prot、(272.34±4.26)U/mg prot]、 G

9、SH-Px[(181.72±10.24)mU/mg、(278.82±3.68)mU/mg、(248.73±9.42)mU/mg]活力升高， MDA水平[(958.76±21.96)nmol/mg prot、(628.16±14.46) nmol/mg prot、(716.32±17.88) nmol/mg prot]下降（P<0.05）。（4）熒光倒置顯微鏡下顯示，與Control組比較，Model組PC12細(xì)胞熒光增強(qiáng)，線粒體膜電位耗

10、散量增加，ROS增加；與Model組比較，IRN組PC12細(xì)胞熒光減弱，膜電位耗散量減低，ROS減少。(6)ELISA檢測結(jié)果顯示，與Control組TNF-α水平[(546.34±11.78)pg/mL]比較，Model組TNF-α水平[(894.18±11.96)pg/mL]升高（P<0.05）；與Model組比較， IRN各組 PC12細(xì)胞 TNF-α水平[(838.24±10.16)pg/mL、(718.26±10.82)pg/

11、mL、(786.44±8.26)pg/mL]下降（P<0.05）。（7）Western blot結(jié)果顯示，與Control組NF-κB(1.03±0.00)、Bcl-2(1.16±0.00)、Bax(1.28±0.00)、Caspase-3(0.76±0.00)、IL-1β(0.84±0.00)和Cyt C(0.80±0.00)表達(dá)水平比較，Model組 NF-κB(2.43±0.01)、Bax(2.32±0.01)、Caspase-3

12、(2.35±0.01)、IL-1β(2.72±0.01)和Cyt C(1.21±0.01)表達(dá)升高（P<0.05），Bcl-2(0.74±0.01)表達(dá)下降（P<0.05）；與Model組比較，IRN-20和IRN-80組PC12細(xì)胞NF-κB[(1.58±0.02)、(2.19±0.02)]、Bax[(1.36±0.02)、(1.44±0.02)]、 Caspase-3[(0.82±0.02)、(0.75±0.02)]、IL-1β[(

13、1.65±0.02)、(1.30±0.02)]和Cyt C[(0.78±0.02)、(0.93±0.02)]表達(dá)水平下降（P<0.05）, Bcl-2(1.55±0.02)、(1.45±0.02)]表達(dá)升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：IRN可提高Aβ25-35損傷的PC12細(xì)胞存活率和增殖率，改善Aβ25-35損傷線粒體所引起的PC12細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能為：（1）IRN通過減少ROS和MDA水平，增加SOD及GSH-PX活力，