銀杏葉提取物及磷酸肌酸鈉對Aβ25-35致PC12細(xì)胞凋亡保護(hù)作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：本文通過淀粉樣蛋白β(Aβ)25-35誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞凋亡，建立阿爾茨海默病的細(xì)胞膜型，并給予銀杏葉提取物(EGB)及磷酸肌酸鈉(PCr)進(jìn)行干預(yù)，了解二者是否對Aβ25-35所致的神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用。 方法：取對數(shù)生長期PCI2細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后，以104/mL的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時后，半量換液，并加入不同濃度的A 13 25.35(A：0 μmol/L(對照組)、B：10 μmol/L、C：20 μmol

2、/L、D：30 μmol/L、E：40 μmol/L)。培養(yǎng)24小時后測得細(xì)胞存活率，應(yīng)用SPSS軟件選擇方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在Aβ25-35濃度為30 μmol/L時對PCI2細(xì)胞的損傷效果明顯。按相同條件進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24小時后加入Aβ 25-35，濃度為30 μmol/L，12小時后，按下面分組方法分別加入銀杏葉提取物及磷酸肌酸鈉：銀杏葉提取物A：A βOumol(對照組)、B：Aβ30umol/L、C：Aβ330umol/

3、L+EGB 1 00mg/L、D：Aβ30umol/L+EGB200mg/L、E:Aβ 30umol/L+EGB400mg/L，磷酸肌酸鈉組A：A β 0umol/L(對照組)、B：Aβ30umol/L、C：Aβ30umol/L+PCrlommol/L、D：Aβ30umol/L+Cr20mmol/L、E：Aβ 30umol/L+PCr 30 mmol/L。培養(yǎng)12小時后，CCK-8法測細(xì)胞存活率，統(tǒng)計分析后得出，銀杏葉提取物組200mg

4、/L，磷酸肌酸鈉組20mmol/L對細(xì)胞保護(hù)作用明顯。按上述方法用A β 25-35濃度為30μmol/L損傷PCI2細(xì)胞，12小時后予銀杏葉提取物組(200mg/L)，PCr組(20mmol/L)保護(hù)細(xì)胞，培養(yǎng)12小時后，用線粒體膜電位特異熒光探針JC-1標(biāo)記PCI2細(xì)胞，啟動共聚焦顯微鏡，選擇488nm氬離子激光和543nm氦氖激光作為激發(fā)光，選擇530±15 nm和615±30 nm通道作為接收通道，啟動計算機(jī)運(yùn)行Lasersha

5、rp2000軟件，掃描圖象，最后將圖象在Laserpix軟件中進(jìn)行處理。同時將濃度為104/mL的細(xì)胞，以600轉(zhuǎn)/分的速度進(jìn)行細(xì)胞甩片后，按TUNEL凋亡試劑盒的操作步驟檢測細(xì)胞凋亡，計算細(xì)胞凋亡率，采集圖像。采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果：在Aβ25-35濃度為30 μmol/L時，對PCI2細(xì)胞損傷效果明顯，與0μmol/L，10 μ mol/L，20μmol/L組有顯著差異(P＜0.01)，而和40μmol/L組，差異

6、不明顯(P＞0.01)。以不同濃度的銀杏葉提取物及磷酸肌酸鈉進(jìn)行干預(yù)后，測量OD值，采用方差分析法得出EGB200mg/L組與Aβ30umol/L，EGB100mg/L組差異明顯(P＜0.01)，而和400mg/L組及Aβ0umol/L組無明顯差異(P＞0.01)，PCr 20mmol/L與Aβ30umol/L，PCr10mmol/L組差異明顯(P＜0.01)，和PCr 30mmol/L組無明顯差異。線粒體膜電位示30umol/L的Aβ

7、處理PCI2細(xì)胞(簡稱為Aβ組，下同)24小時后，紅色熒光強(qiáng)度明顯降低，綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，即線粒體膜電位(MMP)降低。而以Aβ30umol/L+EGB200mg/L組處理PCI2細(xì)胞(簡稱為銀杏組，下同)及Aβ30umol/L+PCr20mmol/L組同時處理PCI2細(xì)胞(簡稱為磷酸肌酸鈉組，下同)后，紅色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，綠色熒光強(qiáng)度明顯降低，即線粒體膜電位(MMP)升高。Aβ組(30umol/LAβ)、EGB組(Aβ330 u

8、mol/L+EGB 200mg/L)及PCr組(Aβ30umol/L+PCr 20mmol/L)均可見TUNEL陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，PO-D標(biāo)記的凋亡細(xì)胞顯綠色熒光；而以DAB顯色，凋亡細(xì)胞核被染成棕色。Aβ組細(xì)胞凋亡率(63％)高于銀杏組(21％)及磷酸肌酸組(22％)(p＜0.01)。結(jié)論：1.濃度為30umol/L的Aβ25-35可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，建立AD的細(xì)胞膜型。2.濃度為200mg/L的銀杏葉提取物及20mmol/L