組蛋白去甲基化酶JMJD2C在非小細胞肺癌干性維持及TKIs獲得性耐藥中的調(diào)控作用.pdf

1、背景：
　　肺癌是當今發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。依據(jù)臨床和病理特征，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)，二者中NSCLC占80.4％。由于大部分肺癌患者被診斷明確時已屬于中、晚期，患者5年生存率往往低于10％。近年來，以含鉑雙藥主的傳統(tǒng)給藥模式的療效遭遇瓶頸，隨著對NSCLC發(fā)病機制及其惡性生物學特征的深入研究，分子靶向治療逐漸成為NSCLC治療研究的焦點。

2、以表皮生長因子受體(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)為靶點的小分子酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)對于攜帶優(yōu)勢突變的患者中顯示出較好的反應率，在晚期進展的NSCLC的治療中獨領(lǐng)風騷。其中，以吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)及?？商婺幔ㄖ袊邪l(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)）為代表的EGFR-TKIs使NSCLC患者顯著獲益。然而隨著E

3、GFR-TKI治療方案的臨床推廣，獲得性耐藥卻不可避免接踵而至。研究證實，50％的肺腺癌患者經(jīng)過EGFR-TKIs治療有效6-12個月后出現(xiàn)獲得性耐藥，患者最終會出現(xiàn)病情進展或復發(fā)。因此，全面了解EGFR-TKIs耐藥機制，探討克服耐藥的策略成為亟待完成的重要課題，以期為NSCLC的個體化、精準治療提供有益參考。
　　腫瘤干細胞(Cancer Stem cells，CSCs)是指存在于腫瘤組織中的具有干細胞性質(zhì)的一小部分細胞群體。

4、具有自我更新、分化潛能及高致瘤性和耐藥性的特點。EGFR-TKIs耐藥可能是一種克隆進化模式，腫瘤細胞發(fā)生遺傳及表觀遺傳學上的改變（選擇壓力及自發(fā)突變影響），如產(chǎn)生的改變具有選擇優(yōu)勢，就可產(chǎn)生對原腫瘤細胞克隆更具競爭力的新腫瘤細胞克隆。CSCs是形成不同分化程度腫瘤細胞和促使腫瘤不斷生長的根源。是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及化療敏感性的決定性因素之一。因此，我們推斷，TKIs在誘導NSCLC EGFR優(yōu)勢突變TKIs-敏感細胞對其產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的過

5、程中，腫瘤干細胞CSCs的逐步富集可能在該過程中發(fā)揮重要作用。
　　JMJD2(Jumonji domain-containing protein)組蛋白去甲基化酶，是一類分子中含有Jumonji結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，包括JMJD2A-JMJD2D。組蛋白去甲基化酶JMJD2C在染色體的結(jié)構(gòu)修飾和基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。近年來，隨著對其晶體學結(jié)構(gòu)、作用機制和生理功能的研究取得的進展，JMJD2C被證實為神經(jīng)干細胞、造血干細胞及

6、胚胎干細胞等增殖分化的核心調(diào)控因子。盡管已發(fā)現(xiàn)JMJD2C參與腫瘤發(fā)生發(fā)展等多樣化生物進程異常，但仍缺乏JMJD2C參與腫瘤干細胞(CSCs)表型和生物學行為調(diào)控的作用及機制研究。
　　目的：
　　本部分研究旨在探索組蛋白去甲基化酶JMJD2C參與NSCLC CSCs干性維持及自我更新的重要調(diào)控作用及其機制;進一步證實EGFR TKIs藥物富集ALDH1bri+ CSCs細胞亞群中JMJD2C水平升高參與NSCLC EGFR

7、 TKIs獲得性耐藥;并觀察JMJD2C小分子抑制劑JIB-04干預對耐藥模型藥物敏感性的影響。研究完善了NSCLC EGFR TKIs獲得性耐藥后續(xù)治療中基礎(chǔ)理論支持，為NSCLCTKIs獲得性耐藥的后續(xù)治療提供全新給藥模式選擇。
　　方法：
　　采用qRT-PCR技術(shù)及Western Blot法對NSCLC高活性乙醛脫氫酶亞型ALDHbri+細胞群和ALDHlow-細胞群的基因表達譜系進行比較分析;通過體內(nèi)、外懸浮培養(yǎng)克

8、隆球形成能力、自我更新能力、倍比稀釋致瘤能力及鼠尾靜脈注射肺部克隆形成實驗，證實JMJD2C參與NSCLC ALDHbri+細胞干性維持及自我更新能力;采用Aldefluor試驗及流式細胞術(shù)檢測JMJD2C小分子抑制劑干預后細胞及小鼠殘余瘤中ALDHbri+亞群百分比;采用qRT-PCR技術(shù)檢測JMJD2C對一系列多潛能相關(guān)性干性核心轉(zhuǎn)錄因子表達調(diào)控;用吉非替尼采用逐步方法去誘導人肺腺癌細胞PC9形成耐藥的細胞株，命名為PC9/GR;細

9、胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)以及細胞生長曲線用CCK-8法去檢測，并根據(jù)公式計算耐藥指數(shù)以及倍增時間;用倒置顯微鏡，去觀察親本株及耐藥株形態(tài)學的改變;用流式細胞術(shù)分別檢測兩細胞株的細胞周期;用Aldefluor試驗以及流式細胞術(shù)分別檢測這兩細胞株中ALDHbri+亞群的百分比;qRT-PCR及Western Blot法檢測JMJD2C基因表達水平差異;用JIB-04干預耐藥株P(guān)C9/GR后再用MTT法、平板克隆法及懸浮培養(yǎng)克隆成球法去檢

10、測其對吉非替尼敏感性的變化及機制;采用裸鼠皮下接種成瘤法進一步觀察吉非替尼及JIB-04單獨或聯(lián)合作用于PC-9/GR后，各組異體移植瘤的緩解水平;采用免疫組織化學法檢測EGFR TKIs敏感及獲得性耐藥NSCLC組織中JMJD2C及ALDH1表達差異及相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　本研究第一部分旨在探討組蛋白去甲基酶JMJD2C在NSCLC中的調(diào)控作用及可能機制。首先，對NSCLC高活性乙醛脫氫酶亞型ALDHbri+細胞群和A

11、LDHlow-細胞群的基因表達譜系進行比較分析，證實，組蛋白去甲基酶JMJD2C在ALDHbri+細胞亞群中表達顯著增高;其次，通過體內(nèi)、外實驗，證實JMJD2C參與NSCLC ALDHbri+細胞群的懸浮培養(yǎng)克隆球形成能力、自我更新能力、分化能力、ALDHbri+亞群百分比及致瘤能力的調(diào)控;進一步，我們證實，JMJD2C通過調(diào)節(jié)一系列多潛能相關(guān)性干性核心轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性及表達，從而參與調(diào)控NSCLC ALDHbri+ CSCs表型、

12、干性維持及自我更新等生物學行為。其中，c-Myc為降低最顯著的干性轉(zhuǎn)錄因子。
　　本研究第二部分旨在探索建立EGFR-TKIs獲得性耐藥人肺腺癌模型，并探討其生物學特性及其耐藥機制。我們研究證實，首先，PC-9/GR細胞株的耐藥指數(shù)顯著高于親本株;細胞生長曲線顯示，PC-9/GR細胞生長較親代細胞慢，倍增時間延長;與親本株相比，PC-9/GR耐藥株的G0/G1期細胞增多，而S期細胞則明顯下降;成功建系之后，我們對耐藥株的分子表型及

13、細胞亞群行進一步分析，發(fā)現(xiàn)PC-9/GR細胞中ALDH1bri+ CSCs亞群比例及JMJD2C表達顯著高于親本株;進一步研究中，我們采用JIB-04，組蛋白去甲基化酶JMJD2C小分子抑制劑，有效的增加了EGFR TKIs-獲得性耐藥NSCLC細胞系PC-9/GR對吉非替尼的敏感性;聯(lián)合給予吉非替尼和小分子抑制劑JIB-04比單藥或?qū)φ战M更有效促進EGFR-TKIs耐藥的異體移植瘤小鼠的腫瘤緩解;這和JIB-04能夠靶向NSCLC異體

14、移植瘤中富含的高比例ALDH1bri+ CSCs密切相關(guān)。組織標本中，我們證實TKIs獲得性耐藥的NSCLC組織中JMJD2C及ALDH1表達顯著高于TKIs敏感NSCLC組織，且兩者呈正相關(guān)。因此，我們證實，NSCLC PC9/GR細胞耐藥性的產(chǎn)生與EGFR TKIs藥物富集ALDH1bri+ CSCs細胞亞群中JMJD2C水平升高有關(guān)。因此，協(xié)同或序貫給予吉非替尼和組蛋白去甲基化酶JMJD2C小分子抑制劑JIB-04治療可能是EGF

15、R TKIs耐藥后NSCLC的一個全新給藥模式選擇。
　　結(jié)論：
　　1.組蛋白去甲基化酶JMJD2C在NSCLC ALDHbri+表型的細胞亞群中表達顯著高于ALDHlow-亞群，因此，推測JMJD2C在維持高ALDHbri+表型的NSCLC腫瘤干-樣細胞(CSCs)發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　2.JMJD2C參與NSCLC ALDHbri+ CSCs細胞群的干性維持及自我更新。
　　3.JMJD2C參與調(diào)控NSC

16、LC一系列干性調(diào)控核心轉(zhuǎn)錄因子，從而參與多潛能干性維持。
　　4.吉非替尼體外濃度遞增誘導法可成功建立EGFR-TKIs耐藥人肺腺癌PC9/GR細胞模型。
　　5.NSCLC PC9/GR細胞耐藥性的產(chǎn)生與EGFRTKIs藥物富集ALDH1bri+ CSCs細胞亞群中JMJD2C水平升高有關(guān)。
　　6.組蛋白去甲基化酶JMJD2C小分子抑制劑JIB-04代表一種新型表觀遺傳抗癌藥，在攜帶EGFR優(yōu)勢突變的NSCLC患者