基于組蛋白去甲基化酶JMJD家族探討血瘀型激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制.pdf

1、目的:
　　研究組蛋白去甲基化酶JMJD家族在激素性股骨頭壞死的表達及其在成人骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化中的作用。
　　方法:
　　1.手術(shù)中從4例非激素性股骨頭壞死患者（對照組）和6例血瘀型激素性股骨頭壞死患者（壞死組）的股骨近端取出骨髓。采用密度梯度離心法提取成人骨髓間充質(zhì)干細胞(hBMSCs)，經(jīng)過純化、培養(yǎng)、傳代后，取第四代(P4)的hBMSCs進行實驗。首先進行hBMSCs的鑒定:采用流式細胞技術(shù)檢測hBMSC

2、s的表面抗原(CD105、CD29、CD73、CD44、CD34、CD45、CD11b/c)，觀察hBMSCs的成骨分化能力（堿性磷酸酶染色和茜素紅染色）和成脂分化能力（油紅染色）。然后提取總RNA，分析組蛋白去甲基化酶JMJD家族的mRNA在血瘀型激素性股骨頭壞死中的表達。
　　2.正常hBMSCs購自Lonza，常規(guī)培養(yǎng)、傳代至P5進行實驗。收集正常hBMSCs成骨分化第0、3、7、14、21天的細胞，提取總RNA進行RNA-

3、seq測序分析，提取總蛋白進行Westernblot實驗。構(gòu)建KDM4A基因沉默和基因超表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞并生產(chǎn)相應(yīng)病毒，觀察沉默或超表達KDM4A后對正常hBMSCs成骨分化的影響，包括堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色、RNA-seq測序分析、Westernblot實驗等。利用JMJD家族基因廣譜抑制劑JIB-04，觀察不同濃度的JIB-04對正常hBMSCs成骨分化的影響，包括堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性檢測

4、、茜素紅染色、RNA-seq測序分析、Westernblot實驗等。
　　結(jié)果:
　　1.從患者骨髓中提取的hBMSCs的表面抗原符合hBMSCs的特征，提取hBMSCs的形態(tài)呈長梭形，具備成骨分化和成脂分化的能力。
　　2.KDM6A和RUNX2基因mRNA的表達在血瘀型激素性股骨頭壞死組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。KDM4A、KDM4B、KDM4D的mRNA表達量隨著正常hBMSCs成骨分化的

5、進程呈現(xiàn)動態(tài)的降低，KDM4C、KDM5B、KDM5C、KDM6A、KDM6B、UTY的mRNA表達量隨著成骨分化的進程呈現(xiàn)動態(tài)的升高。正常hBMSCs在成骨分化第0、3、7、14、21天KDM4A、KDM4B、KDM5A、KDM6B蛋白的表達隨著成骨分化時間的增加，其蛋白表達水平逐漸增加。
　　3.沉默KDM4A以后，無論是在常規(guī)培養(yǎng)基中，還是在成骨分化的培養(yǎng)基中，shKDM4A＃1、shKDM4A＃2與shNeal（對照組）相

6、比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），說明沉默KDM4A對hBMSCs的增殖均無明顯的影響;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色，shKDM4A＃1和shKDM4A＃2均比shNeal明顯減弱;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶活性，shKDM4A＃1、shKDM4A＃2與shNeal相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。說明沉默KDM4A后，hBMSCs成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色和活性均受到明顯的抑制;hBM

7、SCs在成骨分化第14天的茜素紅染色，shKDM4A＃1和shKDM4A＃2均比shNeal明顯減弱，說明沉默KDM4A后，hBMSCs成骨分化的晚期礦化受到了明顯的抑制。RNA-seq結(jié)果顯示，沉默KDM4A以后，shKDM4A＃1、shKDM4A＃2與shNeal相比較，RUNX2、SPP1(OPN)、ALP等基因的mRNA表達明顯降低，這些基因相應(yīng)蛋白的表達水平也相應(yīng)的降低。
　　超表達KDM4A以后，hBMSCs在成骨分化

8、第8天的堿性磷酸酶染色，KDM4A組（野生型）和KDM4AH188A組（突變型）均比Vector組（對照組）明顯增強;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶活性，KDM4A組、KDM4AH188A組與Vector組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。說明超表達KDM4A后，hBMSCs成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色和活性均明顯地升高;hBMSCs在成骨分化第14天的茜素紅染色，KDM4A組和KDM4AH188A組均比Vecto

9、r組明顯增強，說明超表達KDM4A可促進hBMSCs成骨分化的晚期礦化。Westernblot的結(jié)果顯示超表達KDM4A以后，KDM4A組、KDM4AH188A組與Vector組相比較，RUNX2和OPN蛋白的表達均升高了。
　　4.在成骨分化培養(yǎng)基中，與對照組(DMSO)相比較，800nM的JIB-04抑制hBMSCs的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05);100nM、200nM、400nM的JIB-04對hBMSCs的增殖無

10、影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶染色，50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比對照組明顯減弱，JIB-04濃度越高，堿性磷酸酶染色越弱;hBMSCs在成骨分化第8天的堿性磷酸酶活性，50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，JIB-04濃度越高，堿性磷酸酶活性越低。hBMS

11、Cs在成骨分化第16、19、21天的茜素紅染色，50nM、100nM、200nM、400nM、800nM的JIB-04均比對照組明顯減弱，JIB-04濃度越高，茜素紅染色越弱。RNA-seq結(jié)果顯示，100nM、400nM的JIB-04與對照組相比較，RUNX2、SPP1(OPN)、ALP等基因的mRNA表達明顯降低，RUNX2和OPN蛋白的表達水平也相應(yīng)的降低。
　　結(jié)論:
　　KDM6A可能與血瘀型激素性股骨頭壞死發(fā)病機