MGMT-DNA交聯(lián)物檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景和目的:DNA蛋白交聯(lián)物（DPC）是高基因毒性的DNA加合物，是藥/毒物暴露下形成的共價(jià)結(jié)合（Covalent interaction）的交聯(lián)型DNA-蛋白復(fù)合體。由于DPC阻礙了DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是一種嚴(yán)重的DNA損傷方式。甲醛，輻射，氮芥，順鉑1等都可以引起DPC生成，并引起細(xì)胞增殖旺盛的組織，如骨髓、腫瘤等的藥物敏感性增加。但是，DPC形成的規(guī)律、修復(fù)動(dòng)力和機(jī)制仍然不清楚，這主要是因?yàn)镈PC的檢測(cè)方法復(fù)雜，定量困難，難以

2、普遍開展。因此，檢測(cè)DPC的方法學(xué)的進(jìn)步是提升DPC形成和修復(fù)機(jī)制的基礎(chǔ)，探索簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、普及性好的DPC檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。
　　氮芥和硫芥是兩種常見的芥子氣類毒物，也稱起泡劑，屬于糜爛性毒劑。糜爛性毒劑是一類能直接損傷組織細(xì)胞，引起皮膚、黏膜的局部炎癥、壞死，并能通過(guò)皮膚、眼、呼吸道粘膜吸收導(dǎo)致全身中毒的化學(xué)戰(zhàn)劑。其主要的中毒機(jī)制是借助其烷基上活躍的氯基團(tuán)通過(guò)烷化反應(yīng)，與生物分子中的敏感基團(tuán)發(fā)生交聯(lián)，將其烷基連接在生物分子上，

3、故被稱為單/雙功能烷化劑2。芥子氣是一種典型的雙功能烴化劑,可與細(xì)胞內(nèi)的許多重要生物大分子核酸、蛋白質(zhì)、多肽等發(fā)生親核反應(yīng)形成各種加合物。如蛋白質(zhì)中的氨基、亞氨基及其離子化的羧基和巰基都易被烴化，核酸及核酸輔酶中離子化的磷酸第一羥基、第二羥基以及嘌呤堿的7位N原子及鳥嘌呤6位O原子也均可被烴化，因此芥子氣具有復(fù)雜的生物學(xué)作用。
　　O6-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT），一種23kDa的蛋白，與 DNA烷化損傷修復(fù)密切相關(guān)，是目前唯一發(fā)現(xiàn)的

4、在哺乳細(xì)胞中能夠直接移除 O6位點(diǎn)烴化加合物的修復(fù)酶，被認(rèn)為在維持基因組穩(wěn)定性和腫瘤形成中極為重要。MGMT是一種有限的消耗性酶，補(bǔ)充緩慢。MGMT在臨床的腫瘤化療，藥物開發(fā)中均有重要作用。有報(bào)道3，在造血組織高表達(dá)外源性MGMT可增加細(xì)胞對(duì)烷化劑的耐受。這說(shuō)明 MGMT表達(dá)水平與細(xì)胞的烷化劑耐受密切相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在氮芥等雙功能烷化劑作用后，MGMT無(wú)法發(fā)揮移除DNA加合物的正常功能，因?yàn)榇藭r(shí)MGMT被交聯(lián)在DNA上形成MG

5、MT-DNA crosslink（M-DPC）無(wú)法釋放。與其它的DPC損傷一樣，M-DPC被證實(shí)具有致DNA復(fù)制損傷和突變的多重作用。在一些MGMT豐富的組織或細(xì)胞中，雙功能烷化劑引起的M-DPC的增加被認(rèn)為是動(dòng)物/細(xì)胞毒性反應(yīng)的重要原因。在此情況下，檢測(cè)細(xì)胞或組織樣本中M-DPC水平，對(duì)于反映細(xì)胞的損傷程度和藥物敏感性都有重要意義4。
　　DNA-蛋白交聯(lián)體的形成與多種損傷因素的基因和細(xì)胞毒性密切相關(guān)，本課題旨在根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)告

6、的DPC檢測(cè)方法，建立一種基于酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）原理的DPC檢測(cè)方法，并以MGMT形成的DPC為目標(biāo)，觀察氮芥介導(dǎo)的 M-DPC5的形成特點(diǎn)。該方法簡(jiǎn)便、實(shí)用、實(shí)驗(yàn)條件普通、可以在一般實(shí)驗(yàn)室中開展。該方法在臨床中的應(yīng)用，可能會(huì)對(duì)評(píng)價(jià)腫瘤的藥物敏感性和烷化劑的作用機(jī)制有重要的意義。
　　研究?jī)?nèi)容：
　　1.建立氮芥染毒的人支氣管黏膜上皮HBE細(xì)胞模型。通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)和CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，確定適宜

7、的HN2染毒濃度。
　　2.建立基于ELISA的DPC檢測(cè)方法。通過(guò)整合細(xì)胞核抽提/裂解/Tris飽和酚回收的DPC提取純化方法、SYBR Green I的dsDNA檢測(cè)方法，對(duì)DPC的提取、純化、定量方法進(jìn)行簡(jiǎn)化；基于 ELISA原理，建立針對(duì) M-DPC的檢測(cè)方法，并與 slot-blot同步進(jìn)行比較。
　　3.初步研究HN2介導(dǎo)的M-DPC形成的濃度和時(shí)間效應(yīng)，從M-DPC形成動(dòng)力學(xué)角度，揭示雙功能烷化劑作用下，MGM

8、T對(duì)DNA損傷修復(fù)的影響。
　　4.初步研究EGF刺激的細(xì)胞增殖和DVC1蛋白水解作用在M-DPC形成與修復(fù)中的作用。
　　結(jié)果和結(jié)論：
　　1.形態(tài)學(xué)觀察，人支氣管黏膜上皮HBE細(xì)胞HN2染毒24h之后，隨染毒濃度增加細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。10μM HN2對(duì)細(xì)胞的形態(tài)影響不大，30μM和100μM HN2染毒使細(xì)胞發(fā)生脫粘附，圓化，死亡，尤其以100μM HN2為甚℃CK-8檢測(cè)的細(xì)胞活性隨染毒劑量增加而逐漸下降，3

9、0μM活性降至60％，100μM活性降至20%。
　　2.SYBR Green I方法可以在2ng-1.5μg區(qū)間內(nèi)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)dsDNA進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。采用細(xì)胞核抽提/裂解/Tris飽和酚回收法成功抽提包括DPC的dsDNA，用SYBR Green I方法對(duì)其dsDNA進(jìn)行的定量，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到回收量。DNA總量與細(xì)胞的數(shù)量呈很好的線性關(guān)系。
　　3.在20-100 ng上樣量范圍內(nèi)，ELISA方法有很好的顯色反應(yīng)，通

10、過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較可以定量。ELISA方法和slot-blot法對(duì)于M-DPC的檢測(cè)結(jié)果有很好的一致性。
　　4.MGMT在10μM HN2染毒后降低；染毒前加入O6-BG，則MGMT降低更加顯著。MGMT抑制劑O6-BG的使用并未影響HN2的細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞的增殖活力沒(méi)有明顯變化。MGMT在正常細(xì)胞中表達(dá)于胞質(zhì)中，在細(xì)胞核中發(fā)揮甲基轉(zhuǎn)移酶的作用。HN2染毒后 MGMT進(jìn)入胞核增加，并可能以泛素化形式存在故而條帶35kDa高于MGM

11、T單體23kDa6,7。細(xì)胞質(zhì)中對(duì) MGMT以原型存在，染毒后水平降低，可能是進(jìn)入細(xì)胞核增加所致。
　　5.HN2染毒后，M-DPC有顯著增加，且在10-100μM HN2染毒范圍內(nèi)有劑量依賴關(guān)系。從30μM HN2染毒的時(shí)間效應(yīng)上看，染毒3h后，M-DPC水平顯著升高，至24h仍維持在該水平上，初步觀察了HN2介導(dǎo)的M-DPC的形成動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)。
　　6.初步證實(shí)細(xì)胞增殖和DVC1的蛋白水解作用分別參與了M-DPC的形成與修