檢測(cè)miRNA的“Percellome”方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)約22nt，具有調(diào)節(jié)功能的非編碼小RNA。它通過(guò)獨(dú)特的加工成熟以及調(diào)控機(jī)制使靶基因轉(zhuǎn)錄后沉默。miRNA具有調(diào)控發(fā)育時(shí)序，細(xì)胞增殖與死亡以及腫瘤發(fā)生的功能，同時(shí)參與脊椎動(dòng)物心臟、肌肉以及神經(jīng)系統(tǒng)的形成。盡管miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)的miRNA已達(dá)到6396種(http://microma.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml.11.0版本)，但功能明確的miRNA卻少之又少。目前，miR

2、NA的功能研究是通過(guò)檢測(cè)其在不同環(huán)境下的表達(dá)差異性實(shí)現(xiàn)的。因此，建立一套準(zhǔn)確而穩(wěn)定的檢測(cè)方法，尤其是絕對(duì)定量的檢測(cè)方法對(duì)于更深入地研究miRNA的調(diào)控功能至關(guān)重要。 本研究選用3條外源RNA用于計(jì)算RNA在提取過(guò)程中的損失量，同時(shí)設(shè)計(jì)特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物以及PCR引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)14種小鼠腦組織中表達(dá)的miRNA。優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系可以特異性檢測(cè)目的miRNA，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)“Percellome”法在

3、DNA與RNA不同水平進(jìn)行均一化處理，將目的miRNA的熒光信號(hào)值轉(zhuǎn)換為目的miRNA在每個(gè)樣品細(xì)胞中的原始絕對(duì)表達(dá)拷貝數(shù)(拷貝數(shù)/細(xì)胞)。研究結(jié)果表明：經(jīng)DNA水平均一化后，有10種miRNA的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象(其中包括1種miRNA在8周齡小鼠腦組織中無(wú)檢測(cè)信號(hào))，4種miRNA則呈現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象；而經(jīng)RNA水平均一化后，有8種miRNA的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象(其中包括1種miRNA在8周齡小鼠腦組織中無(wú)檢測(cè)信號(hào))，6條miRNA則呈現(xiàn)下調(diào)

4、現(xiàn)象，并且兩種水平均一化的數(shù)據(jù)具有較高的相關(guān)性(R＝0.933)。miR-26a與miR-9在小鼠腦中分別為表達(dá)豐度最高與最低的miRNA；14種miRNA在不同年齡段小鼠腦組織中均有表達(dá)差異，其中表達(dá)差異值在1.7-10.5倍之間(DNA水平)與1.2-12.6倍之間(RNA水平)。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，miRNA常用內(nèi)參照U6ncRNA與5SrRNA在不同年齡段小鼠腦組織中也存在表達(dá)差異。經(jīng)DNA水平均一化處理后，U6ncRNA表達(dá)上調(diào)了1