Mcl-1參與NSCLC細胞對EGFR和ALK抑制劑敏感性調(diào)控的實驗研究.pdf

1、Mcl-1（myeloid cell leukemia-1,Mcl-1）是Bcl-2（B cell lymphoma-2, Bcl-2）抗凋亡蛋白家族成員，參與調(diào)控細胞的凋亡與存活。Mcl-1在許多正常組織中廣泛表達，對維持多種細胞的成熟與分化具有重要的意義。Mc l-1表達的上調(diào)提示了腫瘤的發(fā)生，而在多種人類癌組織中，Mcl-1確實存在過表達現(xiàn)象。此外，Mcl-1的過表達還可以誘導(dǎo)細胞對一些治療藥物產(chǎn)生耐受作用。由此可見，作為癌癥靶向

2、新型位點，Mcl-1在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等抗腫瘤方面可能發(fā)揮重要的作用。本實驗以含EGFR突變的PC-9細胞系以及含 EML4-ALK基因融合的H3122細胞系為研究對象，觀察Mcl-1調(diào)控NSCLC細胞對EGFR和ALK抑制劑敏感性的作用及相關(guān)機制。
　　第一部分：通過Western blot方法，檢測EGFR抑制劑和ALK抑制劑誘導(dǎo)NSCLC細胞凋亡信號通路以及凋亡過程中起關(guān)鍵作用的調(diào)控分子。結(jié)果顯示：EGFR和ALK抑制劑通過

3、調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達，活化Caspase-3信號途徑，進而誘導(dǎo)NSCLC細胞凋亡，Mcl-1則作為參與此凋亡信號通路的一個關(guān)鍵分子。
　　第二部分：觀察Mcl-1調(diào)控NSCLC細胞對EGFR和ALK抑制劑敏感性的作用。實時定量PCR、Western blot以及免疫共沉淀實驗等檢測Mcl-1的表達，結(jié)果顯示GFR和ALK抑制劑并非在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)Mcl-1，而是在蛋白降解水平下調(diào)Mcl-1。過MTT實驗檢測到臨床上還有一些E

4、GFR野生型病人對Gefitinib敏感，而對這些efitinib敏感型細胞給予Gefitinib處理后Mcl-1表達下調(diào)。Westernblot檢測對efitinib敏感細胞及耐藥細胞給予Gefitinib處理后中Mcl-1的表達及細胞的凋亡情，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增大，敏感細胞株凋亡片段增多，Mcl-1表達減少；而藥細胞株未出現(xiàn)明顯的凋亡片段，Mcl-1的表達無明顯減少。特異性敲除耐藥細胞Mcl-1基因，流式細胞技術(shù)檢測細胞，結(jié)果

5、顯示細胞凋亡明顯增多。
　　第三部分：探討Mcl-1調(diào)控EGFR突變細胞對EGFR抑制劑敏感性的相關(guān)機制。Western blot檢測分別給予Gefitinib、Akt抑制劑以及Erk抑制劑處理后，PC-9細胞內(nèi)Mcl-1的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：EGFR抑制劑通過下調(diào)pAkt來抑制pGSK3β的表達，使Mcl-1磷酸化水平增加，進而被泛素修飾，并經(jīng)泛素化途徑降解。通過免疫共沉淀以及Western blot實驗驗證：FBW7是介導(dǎo)Mc