IL-10-hAMSCs的體外鑒定及對小鼠創(chuàng)面愈合中血管相關(guān)因子表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　對IL-10修飾后的hAMSCs（IL-10-hAMSCs）是否改變hAMSCs的表型、生長特性和多向分化能力的生物學(xué)特性進(jìn)行評價，并就IL-10-hAMSCs局部移植對小鼠皮膚全層缺損創(chuàng)面血管相關(guān)因子VEGF、bFGF表達(dá)的影響進(jìn)行檢測分析，為IL-10以及IL-10修飾hAMSCs的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分別對培養(yǎng)的hAMSCs、IL-10修飾的hAMSCs

2、和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hAMSCs進(jìn)行CD73、CD90、CDl05及CD44表型分子鑒定，MTT法繪制各組hAMSCs生長曲線，并用成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)檢測各組hAMSCs的多向分化能力。
　　2.采用細(xì)胞培養(yǎng)劃痕實驗，檢測hAMSCs、IL-10-hAMSCs以及空質(zhì)粒-hAMSCs的遷移能力。
　　3.選擇7周齡健康雄性C57BL/6野生小鼠80只，隨機分成PBS移植組、hAMSCs移植組、IL-10-hAMSCs移植組、空質(zhì)粒

3、轉(zhuǎn)染hAMSCs移植組，每組各20只小鼠。麻醉后在小鼠背部兩側(cè)各切取1cm×1cm大小的全層皮膚缺損創(chuàng)面模型。根據(jù)分組不同，在建模即刻于每個創(chuàng)面周圍皮下多點（創(chuàng)緣各邊中點距創(chuàng)面1mm處）注射100μlPBS懸浮的不同組別的hAMSCs（細(xì)胞總數(shù)為1×106個），PBS移植組注射等量PBS。
　　4.建模后1d、3d、7d、14d，分別處死各組損傷小鼠5只，沿創(chuàng)緣切取創(chuàng)面全層組織。HE染色觀察創(chuàng)面組織中炎性細(xì)胞浸潤及新生血管情況。E

4、LISA檢測小鼠創(chuàng)面組織勻漿中VEGF、bFGF的表達(dá)。免疫熒光染色觀察各組小鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面組織中VEGF、bFGF的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，hAMSCs高表達(dá)CD73（99.85％）、CD90（90.55%）、CDl05（97.95%）及CD44（99.57%），IL-10-hAMSCs高表達(dá)CD73（98.6%）、CD90（93.8%）、CD105（99.8%）及CD44（97.

5、7%），空質(zhì)粒-hAMSCs高表達(dá)CD73（94.1%）、CD90（98.1%）、CD105（96.6%）及CD44（94.8%），三者均不表達(dá)CD34、CD45、CDl1b、CDl9、HLA-DR。表型符合國際細(xì)胞治療協(xié)會就間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志的規(guī)定。各組細(xì)胞生長曲線呈“S”形。IL-10轉(zhuǎn)染后的hAMSCs增殖能力較未轉(zhuǎn)染的hAMSCs以及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的hAMSCs有所下降。生長曲線顯示第3代IL-10-hAMSCs細(xì)胞生長曲線呈“S

6、”形。細(xì)胞培養(yǎng)到21d時，行成骨誘導(dǎo)的茜素紅S染色，可見紅色鈣化結(jié)節(jié)，行成脂誘導(dǎo)的油紅O染色，紅色顯示在脂滴處，IL-10-hAMSCs與hAMSCs、空質(zhì)粒-hAMSCs誘導(dǎo)能力無明顯差別。
　　2.劃痕實驗結(jié)果顯示，IL-10-hAMSCs細(xì)胞在0h與hAMSCs組、空質(zhì)粒組遷移能力基本一致，6h、12h、18h的IL-10-hAMSCs組細(xì)胞向空白區(qū)域遷移能力稍大于hAMSCs組、空質(zhì)粒組，表明IL-10可以增強hAMSc的

7、遷移能力。
　　3.HE結(jié)果顯示：在顯微鏡下觀察，各組小鼠創(chuàng)面組織第1d均有大量炎性細(xì)胞浸潤，可見壞死組織；第3d時各組創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞浸潤較第1d減少，出現(xiàn)大量新生毛細(xì)血管，成纖維細(xì)胞逐漸出現(xiàn)，其中hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組及空質(zhì)粒組小鼠創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞浸潤較PBS組少，成纖維細(xì)胞數(shù)量以及新生毛細(xì)血管生成數(shù)量較PBS組多，其中以IL-10-hAMSCs組最優(yōu)，典型新鮮肉芽組織形成；第7d時各組創(chuàng)面組織炎性細(xì)胞浸潤

8、較第3d明顯減少，成纖維細(xì)胞成熟，數(shù)量較第3d增加，毛細(xì)血管數(shù)量較第3d減少，其中IL-10-hAMSCs組成纖維細(xì)胞數(shù)量較其余三組少，以PBS組最多；第14d時各組小鼠創(chuàng)面未見明顯炎性細(xì)胞，毛細(xì)血管數(shù)量較第7d減少，成纖維細(xì)胞數(shù)量較第7d多，其中IL-10-hAMSCs組成纖維細(xì)胞數(shù)量較其余三組少，PBS組最多。
　　4.ELISA法檢測各組標(biāo)本全層皮膚缺損模型組織中VEGF及bFGF含量，在建模后第1d、3d、7d、14d，P

9、BS組VEGF含量分別為：96.78±4.87、100.84±4.69、103.08±4.21、99.70±5.05ng/L；hAMSCs組VEGF含量分別為：101.77±4.05、115.2±4.03、117.48±6.1、112.61±2.23ng/L；IL-10-hAMSCs組VEGF含量分別為：132.71±3.09、136.86±4.75、142.17±7.39、138.93±5.84ng/L；空質(zhì)粒組VEGF含量分別為：1

10、05.31±4.70、111.89±4.41、115.02±6.96、110.79±3.97ng/L。PBS組bFGF含量分別為：8.78±0.70、11.61±0.22、13.11±0.36、11.20±0.49ng/L；hAMSCs組bFGF含量分別為：9.90±0.44、15.73±1.43、19.50±1.11、16.20±1.96ng/L；IL-10-hAMSCs組bFGF含量分別為：16.70±1.78、21.73±1.85

11、、23.13±1.67、22.19±1.55ng/L；空質(zhì)粒組bFGF含量分別為：9.10±0.64、15.93±1.51、18.90±1.49、16.40±1.66ng/L。各組VEGF、bFGF含量第1d、第3d、第7d逐漸增加，第14d含量較第7d有所下降，hAMSCs組、IL-10-hAMSCs組和空質(zhì)粒組較PBS組在第1d、第3d、第7d的VEGF、bFGF含量明顯增高，且IL-10-hAMSCs組升高更明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

12、義（P＜0.05）， hAMSCs組和空質(zhì)粒組未見明顯差異。
　　5.免疫熒光染色觀察各組標(biāo)本創(chuàng)面組織中VEGF與bFGF表達(dá)情況，在建模后第1d、3d、7d、14d，PBS組VEGF陽性率分別為：33.24±0.85、35.65±1.75、38.57±1.32、34.94±1.25；hAMSCs組VEGF陽性率分別為：37.25±1.05、42.87±0.79、48.92±1.46、43.93±1.68；IL-10-hAMSCs

13、組VEGF陽性率分別為：54.57±1.38、67.10±0.94、71.11±1.53、68.35±1.09；空質(zhì)粒組VEGF陽性率分別為：35.29±0.57、41.34±0.95、48.22±1.44、43.61±1.56。PBS組bFGF陽性率分別為：16.99±1.04、22.00±0.46、25.97±0.70、21.85±1.15；hAMSCs組bFGF陽性率分別為：20.13±1.06、26.20±1.15、31.17±

14、1.21、28.18±0.76；IL-10-hAMSCs組 bFGF陽性率分別為：26.41±0.86、34.42±1.85、38.57±1.33、33.97±0.38；空質(zhì)粒組bFGF陽性率分別為：19.23±1.02、25.16±1.11、30.27±0.93、27.22±1.17。結(jié)果見自第1d、第3d、第7d，VEGF及bFGF陽性率逐漸增加，第14d陽性表達(dá)較第7d稍降低，IL-10-hAMSCs組、hAMSCs組及空質(zhì)粒組陽

15、性率在各時間點均高于PBS組，其中IL-10-hAMSCs組陽性表達(dá)最高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　?。?）采用慢病毒載體搭載IL-10基因修飾后的hAMSCs除細(xì)胞增殖能力受到一定程度的抑制外，不影響hAMSCs的表型特征和多向分化能力的基本生物學(xué)特性；
　?。?）IL-10可增強hAMSCs的遷移能力，移植IL-10-hAMSCs能夠上調(diào)創(chuàng)面組織VEGF以及bFGF的表達(dá)，促進(jìn)血管再生，并