hAMSCs對小鼠創(chuàng)面HA及膠原表達的影響研究.pdf

1、目的：初步探討人羊膜間充質(zhì)干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs）小鼠創(chuàng)面局部移植對ECM中HA及膠原表達的影響，完善hAMSCs促進創(chuàng)面愈合的機制研究，為進一步將hAMSCs轉(zhuǎn)化到臨床應用提供基礎(chǔ)研究。
　　方法：提取 hAMSCs，取其生長良好的第3-5代細胞，采用流式細胞儀分析細胞表面分子標記及成脂和成骨細胞誘導分化鑒定hAMSCs。以96只C57BL/6小鼠為實驗

2、動物，分為正常組（正常小鼠）、對照組（DMEM培養(yǎng)基）及實驗組（hAMSCs移植）三組，每組32只動物，對照組小鼠背部脊柱兩側(cè)建立全層皮膚缺損模型（每只2處，共64處），采用DMEM培養(yǎng)基100uL于64處創(chuàng)面周圍皮下環(huán)形注射，實驗組小鼠背部脊柱兩側(cè)建立全層皮膚缺損模型后同法創(chuàng)面周圍皮下環(huán)形注射hAMSCs（1×106個/mL）100uL,正常組小鼠不制作皮膚創(chuàng)面作為正常對照。在建模后1天、3天、7天、14天分別切取各組創(chuàng)面模型皮膚標本

3、。記錄對照組及實驗組創(chuàng)面愈合過程的大體外觀，并通過細胞示蹤實驗觀察hAMSCs移植后存活狀態(tài)， Masson染色觀察膠原積累情況，免疫組織化學染色后觀察創(chuàng)面皮膚組織高分子量HA陽性表達情況，qPCR技術(shù)測定創(chuàng)面皮膚組織中高分子量HA、I、III的基因表達情況。
　　結(jié)果：人羊膜間充質(zhì)干細胞生長曲線顯示細胞生長曲線呈“S”形，F(xiàn)CM結(jié)果顯示：第4代hAMSCs均高表達CD90、CD105、CD73，其陽性率分別96.6％、95.1%

4、、98.1%，低表達或不表達CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR，其陰性率為0.3%，細胞成脂誘導培養(yǎng)21d時行油紅O染色，可見脂滴處呈紅色；成骨誘導培養(yǎng)21d行茜素紅S染色，可見紅色鈣化結(jié)節(jié)。實驗組小鼠背部創(chuàng)面3、7、14d三個時間點愈合率分別是33.93±2.71、75.17±3.69、98.1±1.66明顯優(yōu)于對照組27.29±3.41、62.37±5.24、95.46±2.56（P＜0.05），并且瘢痕愈合較其

5、他組都小而柔軟；通過細胞示蹤證明局部移植的hAMSCs在建模14d后依舊存活。免疫組織化學染色檢測實驗組高分子量HA表達量，高分子量HA分別在1、3、7、14d表達為40.321±2.348、49.463±1.976、45.463±2.498、40.463±2.341，其表達量呈先遞增后降低趨勢，至3d達到最大表達量，隨之呈降低變化，對照組中高分子量HA分別在1、3、7、14d表達為37.463±2.243、43.463±2.082、3

6、6.463±1.932、30.463±2.987，其表達量與實驗組變化規(guī)律相同，正常組的高分子量HA表達量均在27.463±2.671范圍內(nèi)，每一個時間點均小于實驗組及對照組，而且實驗組每一個時間點均大于對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。qPCR結(jié)果顯示：實驗組高分子量HAmRNA表達在1、3、7、14d分別為0.587±0.046、0.854±0.176、0.679±0.033、0.524±0.066，對照組0.277±0.

7、033、0.376±0.034、0.261±0.046、0.234±0.024，正常組為0.176±0.076，實驗組III型膠原mRNA表達在1、3、7、14d分別為0.215±0.014、0.218±0.026、0.225±0.006、0.216±0.048，對照組0.173±0.009、0.201±0.0035、0.198±0.013、0.199±0.014，正常組為0.151±0.012，實驗組I型膠原mRNA表達在1、3、7、

8、14d分別為0.251±0.028、0.316±0.045、0.322±0.011、0.298±0.021，對照組0.505±0.007、0.547±0.079、0.682±0.195、0.719±0.133，正常組為0.146±0.003，其表達規(guī)律及形式均與免疫組化結(jié)果相對應（P＜0.05），并且I/III型膠原比值在1、3、7、14d實驗組為1.171±0.046、1.469±0.176、1.434±0.033、1.430±0.0

9、66，對照組為2.926±0.333、2.800±0.034、3.481±0.046、3.602±0.024，正常組為0.971±0.076，對照組的比值大于實驗組和正常組，實驗組大于正常組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學意義， Masson染色切片膠原染呈藍色，正常組為正常皮膚組織，膠原排列呈網(wǎng)狀，膠原間間隙較大；1d、3d實驗組較對照組膠原排列緊密，膠原相對變粗，膠原間隙相對變小，染色較深；對照組膠原纖細，排列紊亂，膠原間隙增大，染