吡格列酮對(duì)嚴(yán)重湯傷小鼠創(chuàng)面組織中NF-κB和TNF-α表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　 探討吡格列酮對(duì)嚴(yán)重燙傷小鼠創(chuàng)面組織愈合過程中TNF-α和NF-κB的表達(dá)影響。
　　 方法：
　　 1.建立30％全身體表面積(TBSA)Ⅲ°燙傷小鼠模型
　　 選擇健康SPF級(jí)ICR小鼠130只（天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），雌雄各半，體質(zhì)量29～32g，鼠齡6～8周。小鼠背部按30％TBSA用4％Na2S試劑退毛，腹腔注射4％水合氯醛(40mg·kg-1)麻醉，麻醉成功后將小鼠背部置于

2、100℃熱水中燙12s，制成燙傷面積為30％的Ⅲ°燙傷模型（病理切片證實(shí)，正常組不燙傷），燙傷后立即腹腔注射乳酸鈉林格液(40mg·kg-1)復(fù)蘇。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組
　　 隨機(jī)分成4組，正常組10只，對(duì)照組(Ⅰ)、實(shí)驗(yàn)Ⅱ組、實(shí)驗(yàn)Ⅲ組各40只。建模成功后于每日晨8時(shí)Ⅰ組予以0.5mL·d-1生理鹽水灌胃，Ⅱ、Ⅲ組分別予以10mg·kg-1·d-1、40mg·kg-1·d-1吡格列酮灌胃（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)確定2

3、個(gè)劑量）。吡格列酮每日晨8時(shí)灌胃一次，連續(xù)2周。
　　 3.觀察指標(biāo)
　　 (1)空腹血糖(FBG)
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食過夜，于晨8時(shí)斷頭迅速取血。正常組10只一次性處死，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別于1、3、7、14d各處死10只。各組處死小鼠時(shí)用一次性血糖試紙和血糖儀即時(shí)測量FBG。
　　 (2)空腹胰島素(FIns)
　　 各組分別于1、3、7、14d各處死10只小鼠時(shí)（正常組10只一次性處死），收集血

4、液標(biāo)本2mL于3000r/min、30min、4℃離心。收集血清0.5mL于-80℃保存，用于空腹胰島素測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將制備好的0.5mL血清置于樣品杯中，放置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上（運(yùn)用化學(xué)發(fā)光免疫法測量FIns的含量），調(diào)整好檢測參數(shù)后開始檢測，讀取光量子數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出FIns含量。
　　 (3)計(jì)算IR值
　　 利用穩(wěn)態(tài)模式法(HOMA)計(jì)算IR值:胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FBG(mmo

5、l/L)×FIns(mIU/L)/22.5。
　　 (4)創(chuàng)面組織中TNF-α和NF-κB的表達(dá)
　　 將創(chuàng)面組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，厚度5μm連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟至水后，免疫組織化學(xué)染色（SABC法）檢測TNF-α和NF-κB的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色(DAB顯色)結(jié)果:陽性呈棕黃色顆粒（主要在細(xì)胞漿和/或細(xì)胞核中表達(dá)）。顯微鏡下觀察并截圖:運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖像處理軟件進(jìn)行分析，分別隨機(jī)計(jì)數(shù)每張切片5個(gè)無重復(fù)高倍視野(×400)，

6、測定平均灰度值，以灰度值表示TNF-α和NF-κB的表達(dá)情況。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法
　　 采用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和處理。數(shù)據(jù)均以(x)+s表示，資料采用單因素方差分析(ANOVA)，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.各組小鼠空腹血糖(FBG)的測定
　　 各組處死小鼠時(shí)用一次性血糖試紙和血糖儀即時(shí)測量FBG，檢測結(jié)果顯示Ⅰ、Ⅱ

7、、Ⅲ組FBG與正常組比較具有明顯差異(P＜0.05)。
　　 2.各組小鼠空腹血清胰島素(FIns)的測定
　　 運(yùn)用化學(xué)發(fā)光免疫法測量FIns的含量，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組FIns與正常組比較具有明顯差異(P＜0.05)。
　　 3.各組小鼠胰島素抵抗(IR)
　　 同一時(shí)相點(diǎn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組HOMA-IR值兩兩比較均存在顯著性差異(P＜0.01);同一組內(nèi)不同時(shí)相點(diǎn)HOMA-IR值兩兩比較，均存在差異(P＜0.05

8、或P＜0.01);且分別與正常組HOMA-IR值比較，亦均存在差異(P(0.05)。
　　 4.各組小鼠創(chuàng)面組織中TNF-α的表達(dá)
　　 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組同一時(shí)相點(diǎn)和同一組內(nèi)不同時(shí)相點(diǎn)，TNF-α灰度值兩兩之間分別進(jìn)行比較，均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 5.各組小鼠創(chuàng)面組織中NF-κB的表達(dá)
　　 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組同一時(shí)相點(diǎn)和同一組內(nèi)不同時(shí)相點(diǎn)，NF-κB灰度值兩兩之間分別進(jìn)行比較，均有顯著性差異(P＜

9、0.01)。
　　 結(jié)論：
　　 1.傷后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的小鼠空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素(FIns)較正常組明顯升高，證明30％全身體表面積(TBSA)Ⅲ°燙傷小鼠模型建模成功（病理切片證實(shí)），產(chǎn)生明顯胰島素抵抗(IR)。
　　 2.Ⅰ組與Ⅱ、Ⅲ組空腹血糖(FBG)、空腹血清胰島素值(FIns)比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，證明吡格列酮能有效控制胰島素抵抗(IR)。
　　 3.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組之