小鼠角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子缺失對(duì)創(chuàng)面愈合的影響.pdf

1、目的：生長(zhǎng)因子作為刺激創(chuàng)面細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)發(fā)生增殖和遷移的觸發(fā)者，在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。皮膚是一個(gè)復(fù)雜的器官，為了維持和協(xié)調(diào)皮膚的正常狀態(tài)，其內(nèi)部存在著一系列復(fù)雜的細(xì)胞與細(xì)胞，細(xì)胞與因子，因子與因子間的相互作用機(jī)制。在創(chuàng)傷的愈合過程中，多種生長(zhǎng)因子被證實(shí)在創(chuàng)面的修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的第七個(gè)成員，因此也被稱為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7(FGF-7)。KGF作為一種旁分泌的生長(zhǎng)因子，

2、由各種間質(zhì)細(xì)胞所分泌，包括成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，以及樹突狀表皮T細(xì)胞等。KGF通過表皮細(xì)胞上的特異受體FGFR2-IIIb而發(fā)揮作用。KGF由間質(zhì)細(xì)胞分泌，卻作用于表皮細(xì)胞。在小鼠和人的創(chuàng)傷形成后，KGF的表達(dá)上升160倍。細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)表明，KGF能特定地促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞的增殖與遷移。KGF刺激角質(zhì)細(xì)胞DNA合成的能力比TGF-α和EGF強(qiáng)2-10倍。同時(shí)，有研究表明將KGF外用于創(chuàng)面能有效的促進(jìn)創(chuàng)面的再上皮化。這些研究角質(zhì)都表明

3、了KGF在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)室通過基因敲除獲得KGF基因缺失的小鼠，并對(duì)這種小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育和表型進(jìn)行觀察。同時(shí)，我們通過在KGF基因敲除的小鼠背部建立全層創(chuàng)面模型，來研究KGF在創(chuàng)面愈合的作用及其與皮膚其它細(xì)胞和因子的相互作用。另一方面，隨著全球糖尿病發(fā)病率及患病率迅速增長(zhǎng)，糖尿病的并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病變、糖尿病性腎病、神經(jīng)病變和創(chuàng)面難愈等對(duì)患者極大的威脅。糖尿病患者皮膚很容易受損，創(chuàng)面愈合的能力嚴(yán)重降低，往往反復(fù)發(fā)作，遷

4、延不愈，形成頑固難愈性創(chuàng)面，導(dǎo)致感染，最終致殘。糖尿病難愈創(chuàng)面的修復(fù)成為臨床上面臨的巨大難題。糖尿病小鼠在創(chuàng)面愈合過程中表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，創(chuàng)面血管化受損，以及膠原合成減少。各種生長(zhǎng)因子的表達(dá)也出現(xiàn)異常。然而，有些生長(zhǎng)因子卻能逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠創(chuàng)面的愈合延遲，比如血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族。因此在本試驗(yàn)中，我們采用KGF基因敲除的小鼠和野生型小鼠來研究KGF在全層創(chuàng)面愈合的作用及其與皮膚其它細(xì)胞和因子的相互

5、作用。同時(shí)，通過雜交獲得KGF敲除的糖尿病小鼠，并建立創(chuàng)面模型，探討KGF在糖尿病創(chuàng)面中的作用。
　　 方法：1.KGF的基因，包括三個(gè)外顯子(extron)和兩個(gè)內(nèi)含子(intron)。在KGF的三個(gè)外顯子中，一號(hào)外顯子的作用被認(rèn)為是其中最不可替代的一個(gè)。因此，本實(shí)驗(yàn)室的Guo等利用胚胎干細(xì)胞技術(shù)，通過破壞一號(hào)外顯子達(dá)到敲除KGF的目的，獲得了KGF基因敲除的小鼠。KGF基因敲除小鼠為研究其功能提供了重要工具。同時(shí)，為了探討K

6、GF基因在糖尿病小鼠中的作用，我們通過雜交的方式，獲得了一種KGF基因敲除的糖尿病小鼠。通過KGF基因敲除小鼠和雜交的KGF基因敲除的糖尿病小鼠來作為探討KGF對(duì)小鼠創(chuàng)面愈合作用的基礎(chǔ)。為了得到KGF敲除的糖尿病小鼠我們采用雄性KGF敲除的小鼠(KGF-/-Lepr+/+)和雜合子的雌性基因型糖尿病小鼠(KGF+/+Leprdb/+)來進(jìn)行雜交獲得種畜，將其中含Leprdb/+基因的小鼠選出來，將含有該基因的公鼠與母鼠雜交。利用sout

7、hern雜交和PCR對(duì)他們的后代進(jìn)行基因型鑒定，根據(jù)其不同的基因型而分成四組：KGF敲除的糖尿病小鼠組(Exp.，KGF-/-Leprdb/db)，糖尿病小鼠組(Db/db，KGF+/+Leprdb/db)，KGF敲除小鼠組(KGF null，KGF-/-Lepr+/+)和野生型小鼠組(WT，KGF+/+Lepr+/+)，并對(duì)這四組小鼠進(jìn)行觀察。
　　 2.在KGF基因敲除小鼠(KGF null，n=12)和野生型小鼠(WT，n

8、=12)背面建立全層創(chuàng)面模型。采用測(cè)量面積的方法計(jì)算創(chuàng)面創(chuàng)面開放率，創(chuàng)面收縮率，創(chuàng)面再上皮化率。在傷后第七天，兩組小鼠各隨機(jī)安樂死處死6只，一半組織用于免疫組化染色HE染色觀察創(chuàng)面上皮化情況，Ki-67染色觀察創(chuàng)面基底角質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂，CD-31染色觀察創(chuàng)面血管化情況；另一半用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原(Col-I)，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EG

9、F)，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。
　　 3.在KGF基因敲除糖尿病小鼠(Exp.，n=8)和基因型糖尿病小鼠(Db/db，n=8)背面建立全層創(chuàng)面模型。采用測(cè)量面積的方法計(jì)算創(chuàng)面創(chuàng)面開放率，創(chuàng)面收縮率創(chuàng)面再上皮化率。在傷后第七天，兩組小鼠各隨機(jī)安樂死處死4只，一半組織用于免疫組化染色HE染色觀察創(chuàng)面上皮化情況，Ki-67染色觀察創(chuàng)面基底角質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂，CD-31染色觀察創(chuàng)面血管

10、化情況；另一半用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)Col-I，α-SMA，TGF-β1，bFGF，EGF，IGF-1和VEGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.KGF基因敲除的小鼠表現(xiàn)出凌亂而油膩的皮毛。KGF基因敲除小鼠毛囊排列更為紊亂。KGF基因敲除的糖尿病小鼠與糖尿病小鼠的體重明顯重于KGF基因敲除小鼠和野生型小鼠。并且，KGF基因敲除的糖尿病小鼠體重稍微輕于糖尿病小鼠。KGF基因敲除的糖尿病小鼠既有糖尿病小鼠肥胖的表現(xiàn)型，同時(shí)也表現(xiàn)出KGF基因敲

11、除小鼠的凌亂和油膩的皮毛外觀。
　　 2.KGF基因敲除小鼠與野生型小鼠創(chuàng)面愈合沒有顯著差別，KGF的缺失對(duì)創(chuàng)面開放率，創(chuàng)面收縮率，創(chuàng)面再上皮化率均未造成影響。KGF敲除組創(chuàng)面角質(zhì)細(xì)胞增值率明顯下降，上皮組織遷移和面積的測(cè)量結(jié)果顯示KGF基因敲除組創(chuàng)面的上皮化略低于野生組，但兩組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。KGF敲除組的血管密度明顯低于野生組。在傷后第7天，創(chuàng)面組織中Col-I，α-SMA，TGF-β1，bFGF，EGF，IGF-1在

12、兩組中的表達(dá)沒有差別。VEGF在KGF敲除組中的表達(dá)卻明顯降低。
　　 3.KGF基因敲除糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合明顯慢于對(duì)照組，KGF的缺失對(duì)創(chuàng)面開放率，創(chuàng)面再上皮化率均未造成影響，但使創(chuàng)面收縮率下降。兩組創(chuàng)面基底角質(zhì)細(xì)胞增值率，上皮化以及血管密度無明顯差別。在傷后第7天，創(chuàng)面組織中Col-I，α-SMA，TGF-β1，bFGF，EGF，IGF-1和VEGF在兩組中的表達(dá)沒有差別。
　　 結(jié)論：1.KGF基因敲除影響了小鼠毛

13、囊的發(fā)育從而造成其皮毛外觀的改變。雜交獲得的KGF基因敲除的糖尿病小鼠既有糖尿病小鼠肥胖的表現(xiàn)型，同時(shí)也表現(xiàn)出KGF基因敲除小鼠的凌亂和油膩的皮毛外觀。
　　 2.正常小鼠KGF基因敲除并未影響創(chuàng)面愈合，KGF的缺失使角質(zhì)細(xì)胞增值率明顯下降，但創(chuàng)面仍能正常上皮化。KGF的缺失使創(chuàng)面血管化程度和VEGF的表達(dá)明顯降低，說明KGF對(duì)創(chuàng)面血管化和VEGF的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用。
　　 3.糖尿病小鼠KGF基因敲除通過降低創(chuàng)面收縮影響