14-3-3ζ結(jié)合aPKC-ι經(jīng)上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化促進膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、第一部分、14-3-3ζ和aPKC-ι在膽管癌組織中表達及其與臨床預(yù)后的關(guān)系
　　目的：檢測14-3-3ζ和aPKC-ι在膽管癌組織中的表達，明確二者間的相互關(guān)系，并進一步探討二者的表達與膽管癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　方法：運用免疫組織化學(xué)（IHC）、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和免疫印跡法（WB）的方法檢測64例臨床膽管癌患者的手術(shù)標本中14-3-3ζ、aPKC-ι和E-cadherin在癌組織與癌旁組織的差

2、異表達，另外，取10例膽管囊腫組織做陰性對照?？ǚ綑z驗和t檢驗檢測14-3-3ζ和aPKC-ι與膽管癌病理分化和TNM分期的關(guān)系；Spearman相關(guān)性分析法分析二者之間相關(guān)性；Kaplan-Meier法計算二者的表達與膽管癌患者總體生存得關(guān)系；Cox多因素回歸分析分析膽管癌患者預(yù)后獨立影響因素。
　　結(jié)果：在mRNA和蛋白質(zhì)水平，14-3-3ζ在膽管癌組織中顯著高表達，在癌旁組織和癌旁組織呈低表達；14-3-3ζ和 aPKC-ι

3、在膽管癌組織中協(xié)同高表達，二者呈正相關(guān)，并且與E-cadherin表達相反；14-3-3ζ和aPKC-ι二者的高表達與膽管癌的病理分化和TNM分期密切相關(guān)，二者共同低表達的患者總體生存時間較共同高表達者或單一低表達者生存時間長，Cox多因素回歸分析14-3-3ζ是膽管癌預(yù)后的獨立影響因素。
　　結(jié)論：14-3-3ζ和 aPKC-ι協(xié)同促進膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，14-3-3ζ是膽管癌預(yù)后的獨立影響因素，可作為預(yù)測膽管癌預(yù)后的

4、指標。
　　第二部分、14-3-3ζ與aPKC-ι結(jié)合并相互調(diào)節(jié)
　　目的：在第一部分研究基礎(chǔ)上進一步明確14-3-3ζ與aPKC-ι之間的相互關(guān)系。
　　方法：通過CO-IP實驗初步檢測14-3-3ζ與aPKC-ι是否存在特異性的直接結(jié)合關(guān)系。并運用小分子干擾技術(shù)，合成14-3-3ζ-siRNA，aPKC-ι-siRNA和aPKC-ι過表達載體，構(gòu)建穩(wěn)定的14-3-3ζ低表達、aPKC-ι低表達和aPKC-ι高表達人

5、膽管癌細胞系。通過qRT-PCR、WB和IF檢測靶向沉默14-3-3ζ或aPKC-ι以及aPKC-ι-siRNA拯救實驗中，相應(yīng)aPKC-ι或14-3-3ζ的表達情況。
　　結(jié)果：CO-IP結(jié)果提示，經(jīng)14-3-3ζ與aPKC-ι抗體沉淀的人膽管癌組織和細胞蛋白中，WB可檢測出相應(yīng)的aPKC-ι和14-3-3ζ蛋白條帶；在體外，靶向沉默人膽管癌細胞中14-3-3ζ或aPKC-ι表達后，相應(yīng)的出現(xiàn)aPKC-ι或14-3-3ζ表達下降

6、現(xiàn)象；并且在aPKC-ι-siRNA拯救實驗中，伴隨著aPKC-ι表達恢復(fù)的同時，14-3-3ζ表達亦出現(xiàn)升高。
　　結(jié)論：在人膽管癌中，14-3-3ζ與aPKC-ι存在特異性的直接結(jié)合關(guān)系，并且二者通過結(jié)合而互相調(diào)節(jié)。
　　第三部分、14-3-3ζ-aPKC-ι復(fù)合物促進膽管癌細胞上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化
　　目的：進一步探討14-3-3ζ對人膽管癌細胞EMT轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制。
　　方法：通過TGF-β1誘導(dǎo)構(gòu)建人膽管

7、癌細胞EMT體外模型，并運用小分子干擾技術(shù)和siRNA拯救實驗，靶向調(diào)控膽管癌14-3-3ζ和aPKC-ι的表達，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變，以及qRT-PCR、WB和IF檢測EMT表型標志物。
　　結(jié)果：通過TGF-β1誘導(dǎo)構(gòu)建人膽管癌細胞EMT體外模型，檢測細胞形態(tài)學(xué)變化有短梭形或三角形以及多邊形變?yōu)榧氶L的纖維狀或長梭形；EMT標志物：上皮樣表型E-cadherin和β-catenin表達減少，而間質(zhì)樣表型N-cadheri

8、n和Vimentin表達增多；以及transwell侵襲實驗檢測細胞EMT轉(zhuǎn)化后細胞侵襲移動能力增強。然后當靶向沉默人膽管癌細胞中14-3-3ζ或 aPKC-ι的表達，TGF-β1刺激引起轉(zhuǎn)變?yōu)榧氶L的纖維狀或長梭形的細胞數(shù)目減少，EMT標志物無明顯變化。另外，aPKC-ι-siRNA拯救實驗提示，伴隨aPKC-ι的表達恢復(fù)，14-3-3ζ的表達亦得以升高，同時EMT標志物的變化再次出現(xiàn)典型的EMT轉(zhuǎn)化表型標志物變化。
　　結(jié)論：在

9、體外，14-3-3ζ通過與aPKC-ι結(jié)合形成復(fù)合物，促進人膽管癌細胞EMT轉(zhuǎn)化。
　　第四部分、靶向沉默14-3-3ζ在體內(nèi)外抑制膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移及增殖
　　目的：通過體外、體內(nèi)實驗驗證靶向沉默14-3-3ζ對膽管癌增殖和轉(zhuǎn)移的作用。
　　方法：通過Transwell侵襲實驗、劃痕實驗和克隆平板實驗體外驗證靶向沉默14-3-3ζ對膽管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用；通過裸鼠皮下移植瘤實驗、肺轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建，并且皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)

10、移瘤行HE染色、IHC染色檢測，以及皮下移植瘤行qRT-PCR和WB檢測，體內(nèi)驗證靶向沉默14-3-3ζ對膽管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移作用。
　　結(jié)果：在體外，靶向沉默14-3-3ζ后，Transwell侵襲試驗中膽管癌細胞穿透基底膜的細胞數(shù)目減少；劃痕實驗中細胞移動的速率下降；克隆平板實驗中細胞克隆數(shù)目減少。在體內(nèi)，靶向沉默14-3-3ζ后，皮下移植瘤成瘤能力顯著下降；而肺轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目亦顯著減少；經(jīng)IHC、qRT-PCR和WB檢測證實