Deinococcus radiodurans磷酸戊糖途徑的缺失突變及其在DNA損傷修復(fù)中的功能分析.pdf

1、極端耐輻射微生物和耐輻射微生物DNA損傷修復(fù)機(jī)制研究對于環(huán)境保護(hù)和生物修復(fù)、人類健康以及生物技術(shù)創(chuàng)新等有著重大的理論和應(yīng)用意義，是目前全球研究的熱點(diǎn)。本研究以耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)CGMCC1.633為材料，開展了磷酸戊糖途徑(PPP)對DNA損傷修復(fù)的促進(jìn)作用的研究。同時(shí)為開發(fā)新的耐輻射微生物資源，從新疆戈壁土壤樣品中我們分離鑒定了一株具有較強(qiáng)輻射抗性的微生物—Kocuriasp.I-7。

2、 磷酸戊糖途徑(PPP)是糖、脂肪酸、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸代謝的樞紐，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH，由zwf基因編碼)是PPP中6-磷酸葡萄糖代謝生成核糖-5-磷酸的第一個(gè)關(guān)鍵酶，也是限速酶；轉(zhuǎn)醛酶(TAL)是磷酸戊糖途徑的另一個(gè)關(guān)鍵酶，該基因的突變可引起核糖-5-磷酸胞內(nèi)的積累。已有的研究表明:D.radiodurans磷酸戊糖途徑(PPP)的缺失增加了細(xì)胞對紫外線、MMC和H2O2的敏感性，認(rèn)為磷酸戊糖途徑在核苷酸切除修

3、復(fù)系統(tǒng)、錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)缺失背景下參與和促進(jìn)了細(xì)胞DNA切除和錯(cuò)配修復(fù)作用。本研究構(gòu)建了G6PDH編碼基因的缺失突變株(△zwf和PPP中轉(zhuǎn)醛酶基因的缺失突變株(△dr1337)。比較分析細(xì)胞的倍增時(shí)間，野生型倍增時(shí)間為2.51h，發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的缺失導(dǎo)致細(xì)胞生長速度減弱(倍增時(shí)間2.74h)；轉(zhuǎn)醛酶的缺失提高了細(xì)胞核糖-5-磷酸含量，但并不影響細(xì)胞的生長(倍增時(shí)間2.49h)。突變株的對伽瑪輻射、紫外線、MMC和H2O2的抗性

4、分析顯示△zwf細(xì)胞對這些DNA損傷試劑敏感；進(jìn)一步利用PPP途徑的代謝產(chǎn)物對△zwf進(jìn)行代謝物補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果表明葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯、D-核糖及核苷酸合成前提物質(zhì)(IMP與UMP)能完全或部分恢復(fù)△zwf細(xì)胞的生長和對DNA損傷試劑的抗性，證實(shí)PPP促進(jìn)DNA損傷修復(fù)的作用；而轉(zhuǎn)醛酶(TAL)的阻斷在一定程度上增強(qiáng)了細(xì)胞(△dr1337菌株)對DNA損傷試劑抗性。研究結(jié)果表明PPP產(chǎn)生的NADPH還原力和核酸合成的前體——核糖-5-

5、磷酸有助于DNA誘發(fā)損傷后的修復(fù)，而轉(zhuǎn)醛酶的缺失導(dǎo)致了核糖-5-磷酸的積累在一定程度上促進(jìn)了DNA損傷修復(fù)。 為獲取新的耐輻射微生物資源，我們從新疆戈壁干燥的環(huán)境中分離到多株具有耐受10kGray劑量伽瑪輻射的微生物菌株，對其中一株編號為I-7的菌株進(jìn)行了16SrDNA序列測定，并對其16SrDNA基因序列(1435bp)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析比較，發(fā)現(xiàn)該菌與多種Kocuria屬菌株聚為一類，其16SrDNA序列與Kocuriaro