MxIRT1的定位及信號肽和可變區(qū)缺失突變的克隆、功能分析.pdf

1、本文首先通過PCR擴增的方法得到小金海棠MxIRTl去信號肽和可變區(qū)區(qū)域的亞克隆，并將其構(gòu)建到不同營養(yǎng)缺陷篩選型的酵母表達載體，轉(zhuǎn)化不同二價金屬離子轉(zhuǎn)運體的酵母突變株，通過營養(yǎng)缺陷篩選陽性轉(zhuǎn)化子。運用酵母的異源互補法結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜儀對不同載體轉(zhuǎn)化的酵母細胞進行了體內(nèi)各種離子含量的測定結(jié)果證實了MxIRTl能夠轉(zhuǎn)運二價金屬陽離子，但轉(zhuǎn)運效率不同。MxIRTl對于Cd有較強的轉(zhuǎn)運能力：對Zn、Fe的吸收有一定作用；可以轉(zhuǎn)運Ni、C

2、o、Cu；而與Mn的轉(zhuǎn)運作用不明顯。同時可以證明，過量可被細胞吸收的重金屬離子都對其有一定的毒害，只是細胞的吸收量和可承受量因金屬離子不同而有所不同。Cd的毒害最嚴重，微量即可抑制細胞生長。通過對去信號肽和可變區(qū)的MxlRTl的研究表明，1) MxIRTl前端約105bp的信號肽序列，它的缺失推測會影響到蛋白的功能。2) 存在于跨膜結(jié)構(gòu)域Ⅲ、Ⅳ之間的富含組氨酸的可變區(qū)對于Zn、Fe的轉(zhuǎn)運有一定作用。它的缺失導(dǎo)致酵母對Zn的吸收量有明顯下

3、降。對Fe的影響在吸收量和細胞生長狀態(tài)上也比較明顯。而Cd、Co、Ni的轉(zhuǎn)運只受到較弱的影響。 根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測MxIRTl是一種膜蛋白，為進一步確認它的亞細胞定位，利用構(gòu)建好的誘導(dǎo)型酵母表達載體pYES2.0-MxlRTl：：GFP，通過GFP與活細胞熒光膜染料FM4-64結(jié)合的方法在熒光顯微鏡和共聚焦激光顯微鏡下觀察。初步推斷：MxIRTl定位在質(zhì)膜上；并且其在質(zhì)膜上的分布不是均勻的，而呈現(xiàn)‘脂筏’結(jié)構(gòu)；以半乳糖為碳源誘導(dǎo)表達發(fā)