一個新型細(xì)菌單雜交系統(tǒng)報告載體的構(gòu)建及其在轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用.pdf

1、蛋白質(zhì)和核酸是生命體最為重要的兩類生物大分子?；虻谋磉_(dá)調(diào)控特別是轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要體現(xiàn)為蛋白質(zhì)與DNA分子間特異性的相互作用。因此,發(fā)展有效的DNA.蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)對于深入理解基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制和發(fā)掘新功能基因具有重要意義。
　　 近年來,以生物大分子間親和力為基礎(chǔ)的篩選策略已被廣泛應(yīng)用于鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA分子間的相互作用。本課題基于募集RNA聚合酶實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活這一基本原理,以商業(yè)化的細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)誘餌載體p

2、BT為基礎(chǔ),成功構(gòu)建了能用于分析蛋白質(zhì)-DNA相互作用的細(xì)菌單雜交(B1H)篩選報告載體pBXcmT,并將其應(yīng)用于篩選和鑒定與結(jié)核分支桿菌毒力基因CFP-10上游調(diào)控序列相互作用的潛在轉(zhuǎn)錄因子。本研究取得了以下幾個方面的研究結(jié)果:①以細(xì)菌雙雜交系統(tǒng)報告菌株總DNA為模板,PCR擴(kuò)增獲得了約1.7 kb的His3-aadA報告基因片段,并進(jìn)行了測序驗證；②將pBT載體中λcⅠ和lac-UV5啟動子切除,末端處理后自連環(huán)化,然后將上面獲得的

3、His3-aadA報告基因片段定向克隆到該載體中構(gòu)建了初始報告載體pRpb；③為了有效抑制自激活,降低篩選背景,通過構(gòu)建和篩選部分基因文庫,在pRpb報告基因上游成功引入間隔DNA插入片段,經(jīng)過進(jìn)一步酶切位點(diǎn)修飾,獲得了衍生報告載體pRpb-S7;④構(gòu)建了包含有兩個XcmI位點(diǎn)的媒介DNA片段引入到衍生報告載體pRpb-S7的多克隆位點(diǎn),成功構(gòu)建成報告載體pBXcmT,該載體經(jīng)過XcmI酶切后產(chǎn)生的T-載體可用于目的DNA PCR產(chǎn)物的

4、快速克隆；⑤將結(jié)核分支桿菌H37Rv毒力蛋白CFP-10基因上游的調(diào)控序列克隆到pBXcmT報告基因His3-aadA上游,產(chǎn)生的重組質(zhì)粒通過篩選病原菌基因文庫,共獲得了4個與該調(diào)控序列存在相互作用的潛在轉(zhuǎn)錄因子。
　　 因此,本研究基于商業(yè)化載體pBT成功構(gòu)建了一個新的細(xì)菌單雜交報告載體,該載體不僅無自激活背景,而且在多克隆位點(diǎn)引入了方便的PCR產(chǎn)物克隆策略。與pTRG文庫載體配合使用,該系統(tǒng)不僅可以鑒定和發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子,而