棘孢曲霉JMUdb058柚苷酶的結(jié)構(gòu)及其水解柚皮苷的特性研究.pdf

1、柚苷酶具有α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)兩種活性，在食品及制藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，柚苷酶結(jié)構(gòu)尚不明確，其水解柚皮苷的酶學(xué)性質(zhì)尚未闡明。本論文建立測(cè)定柚苷酶水解柚皮苷的酶活性方法，分離純化棘孢曲霉JMUdb058的柚苷酶，研究其結(jié)構(gòu)及水解柚皮苷的酶學(xué)性質(zhì)。主要結(jié)果如下：
　　 (1)對(duì)柚苷酶水解柚皮苷的酶活性的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。用Waters2695高效液相色譜儀

2、檢測(cè)反應(yīng)體系中的柚皮苷、普魯寧和柚皮素，色譜柱為Symmetry C18，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣20μL；流動(dòng)相為水(A)、甲醇(B)及乙腈(C)，溶劑的梯度洗脫程序是0-7 min，A/B/C=62/12/26；7-9 min，A/B/C=15/35/50；9-15 min，A/B/C=15/35/50；15-17 min，A/B/C=62/12/26；17-20 min，A/B/C=62/12/26。該方法可準(zhǔn)確測(cè)定

3、反應(yīng)體系中的柚皮苷、普魯寧和柚皮素，從而測(cè)定柚苷酶、α-L-鼠李糖苷酶與β-D-葡萄糖苷酶的活力。
　　 (2)利用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow離子層析和SephacylTM S300 HR凝膠層析純化了棘孢曲霉JMUdb058的柚苷酶；SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)該柚苷酶含有4個(gè)亞基，其分子量分別為69 kDa、84 kDa、95 kDa及100 kDa；質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)分子量最小的亞基為α-L-鼠李糖

4、苷酶，另外3個(gè)亞基是β-D-葡萄糖苷酶。
　　 (3)經(jīng)同源性分析及空間結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)棘孢曲霉JMUdb058的α-L-鼠李糖苷酶具有clan-L(alpha/alpha)c6)-桶狀結(jié)構(gòu)的催化結(jié)構(gòu)域，并推測(cè)Asp247，Asp252，Asp259及Glu523是其活性位點(diǎn)；棘孢曲霉JMUdb058的β-D-葡萄糖苷酶具有一個(gè)(α/β)(8)結(jié)構(gòu)域及一個(gè)具有六條(α/β)鏈的三明治結(jié)構(gòu)域，Asp280為該酶的親核位點(diǎn)，Glu509

5、為酸堿催化位點(diǎn)。
　　 (4)棘孢曲霉JMUdb058的柚苷酶及其α-L-鼠李糖苷酶與β-D-葡萄糖苷酶的最適pH均為4，它們?cè)趐H3-6內(nèi)穩(wěn)定；它們的最適溫度分別為50℃、50-60℃及50℃，在50℃以下均較為穩(wěn)定；1 mM與10 mM的Ag+、Fe2+及Fe3+對(duì)三者均有較強(qiáng)的抑制作用。
　　 (5)在50℃、pH4.0、50 mM的檸檬酸鹽緩沖體系中對(duì)柚皮苷進(jìn)行水解，該柚苷酶及其α-L-鼠李糖苷酶與β-D-葡萄糖

6、苷酶的Km分別為0.11 mM、0.23 mM及0.53 mM，Vmax分別為258.6 U/mg、565.1 U/mg及707.6 U/mg，Kcat分別為1500 s-1、3278 s-1及4104 s-1，Kcat/Km分別為14034 s-1×mM-1、14146 s-1×mM-1及7733 s-1×mM-1。
　　 本論文結(jié)果闡明了棘孢曲霉JMUdb058的柚苷酶是由3個(gè)β-D-葡萄糖苷酶亞基及1個(gè)α-L-鼠李糖苷酶亞