中性粒細胞誘捕網(wǎng)對煙草煙霧暴露下漿樣樹突狀細胞的活化作用及紅霉素干預的實驗研究.pdf

1、第—部分、煙草煙霧暴露對小鼠中性粒細胞誘捕網(wǎng)形成的影響及紅霉素干預作用的研究
　　目的：探討煙草煙霧暴露對小鼠中性粒細胞誘捕網(wǎng)(NETs)形成的影響及紅霉素干預的作用。
　　方法：將鼠齡6-8周的雄性Balb/c小鼠按隨機數(shù)字表法分為空氣暴露組、慢性煙草煙霧暴露組，慢性煙草煙霧暴露組用煙草煙霧暴露24周，空氣暴露組空氣偽暴露24周;分離純化小鼠外周血中性粒細胞，免疫熒光法觀察兩組小鼠中性粒細胞形成NETs的情況;分離小鼠血清

2、，觀察兩組小鼠血清對NETs降解的能力;制備CSE，體外觀察煙草煙霧提取物(CSE)刺激中性粒細胞發(fā)生NETosis的情況，同時應用免疫熒光共聚焦法觀察不同刺激因素誘導產(chǎn)生NETs的形態(tài)特征及組成結(jié)構(gòu);探討紅霉素干預對CSE刺激中性粒細胞形成NETs的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠中性粒細胞形成NETs的傾向更為明顯。
　　(2)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠血

3、清對NETs的降解能力明顯減弱。
　　(3)體外研究發(fā)現(xiàn)，CSE刺激能直接誘導中性粒細胞發(fā)生NETosis;與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠中性粒細胞對CSE的刺激更為敏感。
　　(4)免疫熒光共聚焦結(jié)果表明，CSE誘導的NETs在形態(tài)特征及在保守蛋白組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶及髓過氧化物酶的組成上，與PMA誘導的NETs無明顯差別。
　　(5)紅霉素干預能顯著抑制CSE誘導中性粒細胞NETs的形成。

4、r>　　結(jié)論：慢性煙草煙霧暴露環(huán)境中，NETs形成與降解的失衡可能促進小鼠肺部慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。紅霉素干預可能通過抑制煙草煙霧刺激誘導的NETs形成從而減輕肺部炎癥。
　　第二部分、煙草煙霧提取物誘導的中性粒細胞誘捕網(wǎng)對漿樣樹突狀細胞活化的作用及機制研究
　　目的:探討煙草煙霧提取物(CSE)誘導的中性粒細胞誘捕網(wǎng)(NETs)對漿樣樹突狀細胞(pDCs)活化的作用及相關(guān)機制。
　　方法:將鼠齡6-8周的雄性Balb/

5、c小鼠按隨機數(shù)字表法分為空氣暴露組、慢性煙草煙霧暴露組，慢性煙草煙霧暴露組用煙草煙霧暴露24周，空氣暴露組空氣偽暴露24周;HE染色觀察小鼠肺組織病理變化，計算肺泡平均內(nèi)襯間隔(Lm)評估小鼠肺氣腫程度;分離小鼠外周血、脾臟及肺臟單個核細胞，流式細胞術(shù)檢測兩組小鼠Th1、Th17細胞表達情況;免疫磁珠法分選純化空氣暴露組及煙草煙霧暴露組小鼠脾臟pDCs，流式細胞術(shù)檢測兩組小鼠pDCs的表型特征及成熟情況;分離純化小鼠外周血中性粒細胞，制

6、備CSE，體外CSE刺激誘導中性粒細胞形成NETs，提取CSE誘導的NETs;體外以CSE誘導的NETs刺激空氣暴露組小鼠脾臟pDCs，流式細胞術(shù)檢測pDCs共刺激分子的表達情況，ELISA檢測培養(yǎng)液上清IFN-α、IL-6及IL-12p70的濃度;免疫磁珠法分離純化小鼠脾臟初始CD4+T淋巴細胞，建立pDCs-初始CD4+T淋巴細胞共培養(yǎng)體系，流式細胞術(shù)檢測初始CD4+T淋巴細胞的分化情況及轉(zhuǎn)錄因子T-bet、ROR-γt的表達水平。

7、
　　結(jié)果:
　　(1)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠肺泡間隔斷裂，肺泡腔擴大并融合呈肺大皰，Lm值顯著增大。
　　(2)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠外周血、脾臟及肺部CD4+T淋巴細胞表現(xiàn)為Th1、Th17分化優(yōu)勢。
　　(3)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠脾臟pDCs高表達MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD86，表現(xiàn)出成熟及活化的表型特征。
　　(4)體

8、外予CSE誘導的NETs刺激空氣暴露組小鼠脾臟pDCs，結(jié)果顯示CSE誘導的NETs能顯著上調(diào)pDCs表達MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD86，促進pDCs的成熟與活化。
　　(5)予CSE誘導的NETs刺激空氣暴露組小鼠脾臟pDCs，結(jié)果顯示CSE誘導的NETs能有效刺激pDCs分泌細胞因子IFN-α、IL-6及IL-12p70。
　　(6) pDCs-初始CD4+T淋巴細胞共培養(yǎng)實驗證實，與單純pDCs相比，NE

9、Ts刺激活化的pDCs能顯著誘導初始CD4+T淋巴細胞向Th1、Th17細胞分化，刺激IFN-γ及IL-17的分泌。
　　(7)pDCs-初始CD4+T淋巴細胞共培養(yǎng)實驗證實，與單純pDCs相比，NETs刺激活化的pDCs能顯著上調(diào)初始CD4+T淋巴細胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和ROR-γt的表達。
　　結(jié)論:慢性煙草煙霧暴露狀態(tài)下，煙草煙霧誘導的NETs可促進pDCs成熟與活化，繼而啟動Th1、Th17細胞介導的異常免疫反應，可

10、能導致肺部慢性炎癥的放大和持續(xù)。
　　第三部分、穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者外周漿樣樹突狀細胞的表達及意義探討
　　目的:探討穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者外周漿樣樹突狀細胞的表達及意義
　　方法:收集35例2015年5月至2016年5月廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及南寧市第八人民醫(yī)院門診的穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者。同時收集不吸煙健康人15例及吸煙肺功能正常者15例作為對照組。流式細胞術(shù)檢測各組外周血Th1及Th17細胞的表達

11、水平;流式細胞術(shù)檢測各組外周血pDCs的表型特征;ELISA檢測各組血清中pDCs相關(guān)細胞因子IL-6、IL-12及IL-23的濃度;采用相關(guān)性分析慢性阻塞性肺疾病患者血清中pDCs相關(guān)細胞因子IL-6、IL-12及IL-23濃度與外周血Th1及Th17細胞表達水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　(1)外周血CD4+T淋巴細胞在不吸煙健康人、吸煙肺功能正常者及COPD患者三組間差別沒有明顯統(tǒng)計學意義。但與不吸煙健康人、吸煙肺功能

12、正常者相比，COPD患者的外周血Th1與Th17細胞比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(2)與不吸煙健康人、吸煙肺功能正常者相比，COPD患者血清中IFN-γ與IL-17A濃度明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(3)外周血pDCs占PBMC中的比例在不吸煙健康人、吸煙肺功能正常者及COPD患者三組間無明顯差別。與不吸煙健康人相比，吸煙肺功能正常者的外周pDCs表達CD40及CD86明顯上調(diào)，以COPD患者CD40及C