中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)對煙草煙霧暴露下漿樣樹突狀細(xì)胞的活化作用及紅霉素干預(yù)的實驗研究.pdf

1、第—部分、煙草煙霧暴露對小鼠中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)形成的影響及紅霉素干預(yù)作用的研究
　　目的：探討煙草煙霧暴露對小鼠中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)(NETs)形成的影響及紅霉素干預(yù)的作用。
　　方法：將鼠齡6-8周的雄性Balb/c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空氣暴露組、慢性煙草煙霧暴露組，慢性煙草煙霧暴露組用煙草煙霧暴露24周，空氣暴露組空氣偽暴露24周;分離純化小鼠外周血中性粒細(xì)胞，免疫熒光法觀察兩組小鼠中性粒細(xì)胞形成NETs的情況;分離小鼠血清

2、，觀察兩組小鼠血清對NETs降解的能力;制備CSE，體外觀察煙草煙霧提取物(CSE)刺激中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis的情況，同時應(yīng)用免疫熒光共聚焦法觀察不同刺激因素誘導(dǎo)產(chǎn)生NETs的形態(tài)特征及組成結(jié)構(gòu);探討紅霉素干預(yù)對CSE刺激中性粒細(xì)胞形成NETs的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠中性粒細(xì)胞形成NETs的傾向更為明顯。
　　(2)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠血

3、清對NETs的降解能力明顯減弱。
　　(3)體外研究發(fā)現(xiàn)，CSE刺激能直接誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞發(fā)生NETosis;與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠中性粒細(xì)胞對CSE的刺激更為敏感。
　　(4)免疫熒光共聚焦結(jié)果表明，CSE誘導(dǎo)的NETs在形態(tài)特征及在保守蛋白組蛋白、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶及髓過氧化物酶的組成上，與PMA誘導(dǎo)的NETs無明顯差別。
　　(5)紅霉素干預(yù)能顯著抑制CSE誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞NETs的形成。

4、r>　　結(jié)論：慢性煙草煙霧暴露環(huán)境中，NETs形成與降解的失衡可能促進(jìn)小鼠肺部慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。紅霉素干預(yù)可能通過抑制煙草煙霧刺激誘導(dǎo)的NETs形成從而減輕肺部炎癥。
　　第二部分、煙草煙霧提取物誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)對漿樣樹突狀細(xì)胞活化的作用及機(jī)制研究
　　目的:探討煙草煙霧提取物(CSE)誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)(NETs)對漿樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)活化的作用及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:將鼠齡6-8周的雄性Balb/

5、c小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空氣暴露組、慢性煙草煙霧暴露組，慢性煙草煙霧暴露組用煙草煙霧暴露24周，空氣暴露組空氣偽暴露24周;HE染色觀察小鼠肺組織病理變化，計算肺泡平均內(nèi)襯間隔(Lm)評估小鼠肺氣腫程度;分離小鼠外周血、脾臟及肺臟單個核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組小鼠Th1、Th17細(xì)胞表達(dá)情況;免疫磁珠法分選純化空氣暴露組及煙草煙霧暴露組小鼠脾臟pDCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組小鼠pDCs的表型特征及成熟情況;分離純化小鼠外周血中性粒細(xì)胞，制

6、備CSE，體外CSE刺激誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞形成NETs，提取CSE誘導(dǎo)的NETs;體外以CSE誘導(dǎo)的NETs刺激空氣暴露組小鼠脾臟pDCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測pDCs共刺激分子的表達(dá)情況，ELISA檢測培養(yǎng)液上清IFN-α、IL-6及IL-12p70的濃度;免疫磁珠法分離純化小鼠脾臟初始CD4+T淋巴細(xì)胞，建立pDCs-初始CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系，流式細(xì)胞術(shù)檢測初始CD4+T淋巴細(xì)胞的分化情況及轉(zhuǎn)錄因子T-bet、ROR-γt的表達(dá)水平。

7、
　　結(jié)果:
　　(1)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠肺泡間隔斷裂，肺泡腔擴(kuò)大并融合呈肺大皰，Lm值顯著增大。
　　(2)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠外周血、脾臟及肺部CD4+T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為Th1、Th17分化優(yōu)勢。
　　(3)與空氣暴露組小鼠比較，慢性煙草煙霧暴露組小鼠脾臟pDCs高表達(dá)MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD86，表現(xiàn)出成熟及活化的表型特征。
　　(4)體

8、外予CSE誘導(dǎo)的NETs刺激空氣暴露組小鼠脾臟pDCs，結(jié)果顯示CSE誘導(dǎo)的NETs能顯著上調(diào)pDCs表達(dá)MHC-Ⅱ分子及共刺激分子CD40、CD86，促進(jìn)pDCs的成熟與活化。
　　(5)予CSE誘導(dǎo)的NETs刺激空氣暴露組小鼠脾臟pDCs，結(jié)果顯示CSE誘導(dǎo)的NETs能有效刺激pDCs分泌細(xì)胞因子IFN-α、IL-6及IL-12p70。
　　(6) pDCs-初始CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實驗證實，與單純pDCs相比，NE

9、Ts刺激活化的pDCs能顯著誘導(dǎo)初始CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1、Th17細(xì)胞分化，刺激IFN-γ及IL-17的分泌。
　　(7)pDCs-初始CD4+T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實驗證實，與單純pDCs相比，NETs刺激活化的pDCs能顯著上調(diào)初始CD4+T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和ROR-γt的表達(dá)。
　　結(jié)論:慢性煙草煙霧暴露狀態(tài)下，煙草煙霧誘導(dǎo)的NETs可促進(jìn)pDCs成熟與活化，繼而啟動Th1、Th17細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)，可

10、能導(dǎo)致肺部慢性炎癥的放大和持續(xù)。
　　第三部分、穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者外周漿樣樹突狀細(xì)胞的表達(dá)及意義探討
　　目的:探討穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者外周漿樣樹突狀細(xì)胞的表達(dá)及意義
　　方法:收集35例2015年5月至2016年5月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及南寧市第八人民醫(yī)院門診的穩(wěn)定期慢性阻塞性肺疾病患者。同時收集不吸煙健康人15例及吸煙肺功能正常者15例作為對照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外周血Th1及Th17細(xì)胞的表達(dá)

11、水平;流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外周血pDCs的表型特征;ELISA檢測各組血清中pDCs相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-12及IL-23的濃度;采用相關(guān)性分析慢性阻塞性肺疾病患者血清中pDCs相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-12及IL-23濃度與外周血Th1及Th17細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　(1)外周血CD4+T淋巴細(xì)胞在不吸煙健康人、吸煙肺功能正常者及COPD患者三組間差別沒有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。但與不吸煙健康人、吸煙肺功能

12、正常者相比，COPD患者的外周血Th1與Th17細(xì)胞比例明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(2)與不吸煙健康人、吸煙肺功能正常者相比，COPD患者血清中IFN-γ與IL-17A濃度明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3)外周血pDCs占PBMC中的比例在不吸煙健康人、吸煙肺功能正常者及COPD患者三組間無明顯差別。與不吸煙健康人相比，吸煙肺功能正常者的外周pDCs表達(dá)CD40及CD86明顯上調(diào)，以COPD患者CD40及C