福建省六種雙生病毒的分子鑒定及RaMoV NSP互作蛋白的篩選.pdf

1、福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文福建省六種雙生病毒的分子鑒定及RaMoV NSP互作蛋白的篩選姓名：楊彩霞申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：謝聯(lián)輝20090401福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文9 7 ．5 ％，說明它們是同一種病毒的不用分離物。隨機選擇F p l 進行全序列測定及進一步分析。F p l 全長2 8 2 8n t s ( F J 5 1 5 8 9 6 ) ，具有典型的雙生病毒D N A ．A 的基因組結(jié)構(gòu)。F p

2、l D N A ．A 全序列與中國江蘇報道的番薯曲葉病毒的一個分離物S P L C V - [ C N ．J s ：0 8 】( F J l 7 6 7 0 1 ) 相似性最高，為9 2 ．1 ％，說明F p l 是S P L C V 的福建分離物。據(jù)我們所知，這是首次報道S P L C V 可以自然侵染圓葉矮牽牛。通過構(gòu)建S P L C V F p l 分離物的侵染性克隆，并進行致病性測定，結(jié)果表明，F(xiàn) p l A 不能侵染本氏煙。從

3、福建漳州采集到表現(xiàn)明顯黃脈癥狀的一點紅( F z l ．F z 5 ) 和野茼蒿( F z 6 ) 等六個樣品。從這些植物的葉片中提取總D N A 并采用滾環(huán)復(fù)制擴增法檢測。F z l ．F z 6 擴增產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶B a m H I 、E c o R I 、g p nI 、S a cI 、X b aI 和S a l I 處理。F z l ．F z 6 酶切片段( E c o R I 切下的2 ．7 k b ，X b a I

4、切下的1 ．3k b ) 被測序，部分結(jié)果顯示這些植物被同一種病毒侵染。選擇F z l 進行進一步分析。F z l 全長2 7 2 5n t s ( E U 3 7 7 5 3 9 ) ，伴隨的D N A [ 3 全長1 3 3 7n t s ( F J 8 6 9 9 0 6 ) 。F z l 全序列與印度的夜香牛黃脈病毒分離物V e Y V V ．[ I N ：M a d ：0 5 1 ( A M l 8 2 2 3 2 ) 的相似

5、性最高，7 6 ．7 ％。根據(jù)雙生病毒“種”的分類標準，F(xiàn) z l 是一個雙生病毒新種，我們將這個雙生病毒新種命名為一點紅黃脈病毒( E m i l i a y e l l o wv e i nv i r u s ，E m Y V V ) 。我們還構(gòu)建了E m Y W 及其伴隨D N A l 3 的侵染性克隆，致病性測定表明，F(xiàn) z l D N A ．A 可以單獨侵染本氏煙并誘導(dǎo)產(chǎn)生輕微的曲葉癥狀。F z l D N A ．A + D

6、N A l 3 能侵染本氏煙并誘導(dǎo)產(chǎn)生典型的曲葉癥狀。從福建地區(qū)表現(xiàn)黃色花葉癥狀的大青樣品( F z 7 ．F z 9 ) 上分離到雙生病毒。利用簡并引物P A ／P B 對三個分離物進行擴增，獲得的約5 0 0 b p 片段的D N A 序列，其相似性為9 9 ．5 4 ％。隨機選擇分離物F z 7 進行病毒全長基因組的擴增和序列測定。結(jié)果表明，F(xiàn) z 7D N A ．A 全長2 7 7 6 n t s ( F J 0 1 1 6 6

7、 8 ) ，與重瓣臭茉莉金色花葉病毒( C l G M V ) 相似性最高，達8 2 ％，是一新型的雙生病毒，命名為中國大青黃色花葉病毒( C l e r o d e n d r u my e l l o wm o s a i c C h i n a v i r u s ，C 1 Y M C N V ) 。從F z 7 中發(fā)現(xiàn)有D N A ．B 分子，全長2 7 3 9n t s ( F J 0 1 1 6 6 9 ) ，證實C 1 Y

8、 M C N V 是一個新的雙組分雙生病毒。C 1 Y M C N V 侵染性克隆的構(gòu)建為后來的致病性測定做好了準備。通過P C R 擴增獲得了R a M o V 八個功能蛋白的基因A F ／、A V 2 、A C l 、A C 2 、A C 3 ，A C 4 、B V l 和B C l 基因。將B V l 構(gòu)建到酵母雙雜交誘餌載體p G B K T 7 上，把A t ／' ／、A V 2 ，A C l 、A C 2 、A C