用于檢測小鼠卵母細胞及早期胚胎中轉(zhuǎn)錄因子的免疫熒光法研究.pdf

1、本實驗旨在探索有效的染色前固定和滲透卵母細胞及早期胚胎的方法，以提高小鼠卵母細胞和早期胚胎免疫熒光染色的效果；同時檢測RNA聚合酶II(PolII)在小鼠卵母細胞和早期胚胎的表達，探討PolII在卵母細胞和早期胚胎發(fā)育中的作用。為大規(guī)模地精確檢測小鼠卵母細胞和胚胎中的蛋白質(zhì)與轉(zhuǎn)錄因子打下堅實基礎(chǔ)。 以小鼠卵母細胞和早期胚胎為試驗材料，采用4種不同的固定及滲透方法處理。方案A：先用4％多聚甲醛(PFA)固定1h，再用0.5％Tri

2、tonX-100穿透10min；方案B：先用0.5％TritonX-100穿透10min，再用4％PFA固定1h；方案C：用1％PFA+0.2％TritonX-100同時固定與穿透1h；方案D：用-20℃預冷甲醇固定15min，再用0.5％TritonX-100孵育10rain。分析10種轉(zhuǎn)錄因子(TFIIA、TFIIB、TAF1、TAF4、PolII、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母細胞中的免疫熒光染

3、色效果。結(jié)果表明，C方案能夠完全檢測并標記出10種轉(zhuǎn)錄因子的熒光信號，其它3種方案都只能檢測出部分轉(zhuǎn)錄因子的熒光信號；對熒光信號精細分布模式與動態(tài)變化最典型的TFIIB進行仔細分析，表明經(jīng)C方案處理后10種轉(zhuǎn)錄因子抗體標記信號的分布模式很精細，熒光信號的分布清晰，能觀察到信號隨細胞核成熟而發(fā)生的動態(tài)變化，卵母細胞的形態(tài)完好；其它3種方案處理后卵母細胞中雖然能夠觀察到核仁，也能觀察到信號基本均勻地分布于核區(qū)，但不能清楚地顯示熒光信號在核仁

4、內(nèi)是否有分布及信號的動態(tài)變化過程，熒光染色效果不理想。 在光鏡下觀察4種方案處理后的卵母細胞，著重比較GV期、MI期、MII期的卵母細胞和2-細胞期胚胎形態(tài)，C方案處理后的卵母細胞形態(tài)保存較好，GV期細胞核和核仁結(jié)構(gòu)清晰，細胞質(zhì)均勻分布，形態(tài)飽滿；MI期透明帶緊實清晰，厚薄均勻，胞質(zhì)的顆粒狀突起明顯；MII期第一極體結(jié)構(gòu)和2.細胞期的極體結(jié)構(gòu)都保存完好。其它3種方案處理后卵母細胞的形態(tài)變形，各發(fā)育時期的核仁、透明帶、極體等結(jié)構(gòu)受