體外重建人工紅細(xì)胞膜蛋白的免疫熒光法研究及其功能特性分析.pdf

1、傳統(tǒng)的輸血法不能完全解決臨床醫(yī)療和戰(zhàn)場急救等情況下存在的一些實際問題，血液代用品的研究應(yīng)運(yùn)而生。發(fā)展至今，人們已經(jīng)研制出三代血液的代用品，其中，以第三代人工構(gòu)建的紅細(xì)胞與天然紅細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、性質(zhì)上更為接近，有趨于天然紅細(xì)胞的攜氧-釋氧能力。
　　 本課題對基于細(xì)胞骨架重建的紅細(xì)胞其蛋白結(jié)構(gòu)、力學(xué)性質(zhì)及攜氧能力進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上重點利用免疫學(xué)方法對紅細(xì)胞構(gòu)建過程中的膜蛋白進(jìn)行定位示蹤，從微觀角度提供了體外重構(gòu)紅細(xì)胞的可行性的直觀證據(jù)，

2、同時也為人工紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)研究提供了新的途徑。
　　 目的：研究人工紅細(xì)胞功能及性質(zhì)，并且建立免疫技術(shù)對體外重建紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)蛋白研究的方法學(xué)，為血液代用品的研究提供新的參考。
　　 方法：制備人工紅細(xì)胞，觀測其氧飽和-解離曲線（P50）和粘彈性等參量，分析所得人工紅細(xì)胞的攜氧能力及其理化性質(zhì)，并通過免疫熒光的手段，實現(xiàn)對重建人工紅細(xì)胞膜蛋白的原位標(biāo)記，以獲得膜蛋白的結(jié)構(gòu)和分布。
　　 結(jié)果：本課題所制得的人工紅細(xì)胞

3、彈性和表體比均接近于天然紅細(xì)胞，其數(shù)值在天然紅細(xì)胞的范圍內(nèi)。通過氧親和力的測定，得到天然紅細(xì)胞的P50 為26.93，樣品人工紅細(xì)胞P50 值為15.67，數(shù)值上略有差異，說明了人工紅細(xì)胞的氧親和力優(yōu)于天然紅細(xì)胞。從熒光免疫結(jié)果來看，以熒光標(biāo)記兔抗人免疫球蛋白為抗體，采用間接免疫熒光染色法對紅細(xì)胞膜蛋白spectrin al 原位標(biāo)記，在激光共聚焦顯微鏡下以488nm 藍(lán)光激發(fā)熒光，通過對比天然紅細(xì)胞和人工紅細(xì)胞的spectrin 分布

4、，分析人工紅細(xì)胞的構(gòu)象和重建的過程。與天然紅細(xì)胞類似，人工紅細(xì)胞在膜上有血影蛋白分布，且較天然紅細(xì)胞更為均勻。
　　 結(jié)論：在形態(tài)上，重建人工紅細(xì)胞類似于天然紅細(xì)胞，形態(tài)結(jié)構(gòu)上的性質(zhì)與其生物力學(xué)和攜氧-釋氧的功能密切相關(guān)。細(xì)胞穩(wěn)定性測試結(jié)果顯示，人工紅細(xì)胞能夠以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)存在，并且保持良好的生理生化指標(biāo)，通過對其膜蛋白特異熒光定位分析，可以看出人工紅細(xì)胞和天然紅細(xì)胞一樣在膜上分布有特定結(jié)構(gòu)蛋白，說明在細(xì)胞體外重建的過程中，膜蛋白根