Ri質(zhì)粒介導(dǎo)金蕎麥的遺傳轉(zhuǎn)化及毛狀根中類(lèi)黃酮合成的調(diào)節(jié).pdf

1、金蕎麥[Fagopyrum dibotrys(D．Don)Hara]為雙子葉蓼科(Polygonaceae)養(yǎng)麥屬(Fagopyrum MilL.)多年生草本植物，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富并具有重要藥用價(jià)值的資源植物，其主要活性成分為類(lèi)黃酮。近年來(lái)由丁自然環(huán)境的破壞、長(zhǎng)期過(guò)度采挖等原岡，金蕎麥已被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。人工栽培的金蕎麥生物活性成分含量低，藥用品質(zhì)難以保證，而人類(lèi)對(duì)其的需求卻不斷增加，因此開(kāi)拓一新途徑如應(yīng)用生物技術(shù)進(jìn)行毛狀根培養(yǎng)以獲

2、得其有效活性成分，對(duì)保護(hù)金蕎麥植物資源，維護(hù)生態(tài)平衡以及對(duì)我國(guó)中約產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化具有極其重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)建立了發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)的金蕎友高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系,并初步優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因毛狀根合成類(lèi)黃酮的液體培養(yǎng)條件，為篩選金蕎麥代謝突變體和轉(zhuǎn)基因研究奠定了一定基礎(chǔ)。也為研究類(lèi)黃酮代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)化、高效表達(dá)和作用機(jī)理提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.金養(yǎng)麥愈傷組織的獲得 接種時(shí)斜置方式擺放

3、的金養(yǎng)麥種子萌發(fā)早，成苗率高，在7～12d里可獲得96％以上的正常幼苗。從3～5代植株上切取的葉片、葉柄在MS+-BA(2.0mg/L)+IBA(0.2mg，L)培養(yǎng)基中，愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)90％以上，長(zhǎng)出的愈傷組織體積大、疏松，呈白色。 2.發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)的金養(yǎng)麥高頻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立 通過(guò)使用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601對(duì)金蕎麥不同外植體(葉片、葉柄、愈傷組織)進(jìn)行感染。找到可使感染率最高達(dá)80％的最佳實(shí)驗(yàn)方案：葉片、

4、葉柄在MS+BA(2.0mg/L)+IBA(0.2mg/L)培養(yǎng)基中14h光/10h暗條件下培養(yǎng)10～15d獲得愈傷組織，選擇白色疏松愈傷組織為實(shí)驗(yàn)材料。當(dāng)pH5.4～5，8的第二次活化菌液OD600值為0.2～0.4時(shí)，添加100μmol/L的AS誘導(dǎo)30min，然后用它感染白色疏松愈傷組織5～7min。用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液。將愈傷組織接到1/2MS+AS(100μmol/L)培養(yǎng)基中，暗處共培養(yǎng)2～4d。用無(wú)菌水小心清洗5～7次，

5、然后浸泡在Ms+cef(500mg/L)液體培養(yǎng)基中30min。除菌后的材料置入篩選培養(yǎng)基1/2MS+cef(200 mG/L)+Km(20～30 mg/L)中，每7大更換一次新鮮培養(yǎng)基。等根狀物長(zhǎng)至2～4cm長(zhǎng),切下抗Km根系的根尖2～3cm進(jìn)行液體擴(kuò)人培養(yǎng)。獲得的毛狀根表現(xiàn)出激素自養(yǎng)、多根毛、多分枝的特點(diǎn)，但負(fù)向地性不明顯。 3.轉(zhuǎn)基因毛狀根的檢測(cè) 以ro1B基因?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)，從毛狀根中提取到的DNA為模板，檢測(cè)到與陽(yáng)