野生金蕎麥類黃酮次生代謝分子調(diào)控研究——高黃酮含量愈傷系培養(yǎng)、cDNA文庫構(gòu)建及FcDFR和FcMYBP1的克隆與功能的初步鑒定.pdf

1、金蕎麥(Fagopyrum cymosum (Trev.)Meisn)是蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(FagopyrumMill.)多年生草本植物，是一種重要的資源植物，為國家二級(jí)保護(hù)植物。原產(chǎn)于我國西南，分布于陜西、江蘇、浙江、江西、河南、湖北、湖南、廣西、廣東、四川、重慶及云南等省區(qū)。野生金蕎麥中蘊(yùn)涵著豐富的優(yōu)異基因，金蕎麥的塊根活性提取物(主要為類黃酮次生代謝產(chǎn)物)是多種重要的抗癌藥物和癌預(yù)防藥物的主要成分之一。目前，由

2、于人工栽培的金蕎麥產(chǎn)量和品質(zhì)的限制，對(duì)野生金蕎麥資源造成了極大的破壞，這就使野生金蕎麥生物活性物的工廠化生產(chǎn)顯得十分迫切。國內(nèi)外已經(jīng)展開了資源收集、多樣性、生理特性、育種、藥效學(xué)以及生態(tài)環(huán)境等方面的研究，基于活性成分合成的功能基因的研究，國內(nèi)外還未見報(bào)道。 在本研究中，通過獲得高黃酮含量愈傷系，建立野生金蕎麥的RACE cDNA文庫，從中快速分離克隆與藥效成分積累相關(guān)的類黃酮次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶基因(DFR，IFR)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因

3、子P基因，并轉(zhuǎn)化煙草超量表達(dá)進(jìn)行功能的初步驗(yàn)證，為下一步轉(zhuǎn)化野生金蕎麥調(diào)控其類黃酮次生代謝，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。 1、金蕎麥高黃酮含量愈傷系的獲得以消毒金蕎麥種子萌發(fā)的無菌苗的莖與葉片作為外植體，分別在MS添加2.0mg/L，6-BA和0.1mg/L NAA的培養(yǎng)基和MS添加1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的固體培養(yǎng)基上經(jīng)系統(tǒng)誘導(dǎo)并連續(xù)繼代3次，獲得了大量的穩(wěn)定愈傷組織。采用目視法初步篩

4、選出生長(zhǎng)較快、不易褐化、顏色較深或穩(wěn)定并且繼代穩(wěn)定的4個(gè)愈傷系。其中紅色和褐色愈傷系主要來源于莖的誘導(dǎo)，而淺黃色和白色系則來源于葉的誘導(dǎo)用野生金蕎麥無菌苗的莖和葉片作外植體。用分光光度法直接篩選出高類黃酮含量的紅色系，其類黃酮含量為6.3804mg/g，是含量最低的白色系的3.5倍。獲得的來源于莖的高類黃酮含量的紅色愈傷系為進(jìn)一步的細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)和藥用次生代謝產(chǎn)物的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)，也為研究金蕎麥類黃酮次生代謝的分子調(diào)控提供了

5、優(yōu)良的材料。 2、金蕎麥愈傷系cDNA文庫的構(gòu)建利用改良的CTAB結(jié)合LiCl沉淀方法從資源植物金蕎麥愈傷組織中提取出完整性好、純度高的總RNA。用SMART cDNA文庫構(gòu)建試劑盒成功構(gòu)建了金蕎麥紅色愈傷系cDNA文庫。原始文庫滴度達(dá)到1.5×10<'6> pfu/ml，擴(kuò)增文庫滴度約為7.0×10<'9>pfu/ml，重組率達(dá)98％，插入片段在0.5 kb以上，平均約1.1 kb。通過PCR檢測(cè)，從總文庫中檢測(cè)到了低豐度表達(dá)

6、的P基因的特異片段，說明所構(gòu)建的文庫覆蓋度高、代表性強(qiáng)。綜合分析所構(gòu)建的cDNA文庫基本指標(biāo)，表明已獲得高質(zhì)量的金蕎麥愈傷系cDNA文庫，可以用于進(jìn)一步的基因克隆，這是第一次正式報(bào)道金蕎麥eDNA文庫的構(gòu)建。 3、FcDFR基因的克隆與功能初步分析(1)采用RACE結(jié)合cDNA文庫篩選的方法，根據(jù)獲得的DFR同源探針序列，我們從金蕎麥cDNA文庫中克隆到了DFR蛋白基因，命名為FcDFR(登錄號(hào)：EF522145)。 (

7、2)FcDFR基因有一個(gè)長(zhǎng)85bp的內(nèi)含子，有1個(gè)78bp的5’-UTRN、1個(gè)201bp的3’-UTR區(qū)及一個(gè)1026個(gè)核苷酸的開放閱讀框。通過soumem雜交分析，推測(cè)在金蕎麥基因組中DFR基因是1-2個(gè)基因的小家族，F(xiàn)cDFR基因是單拷貝基因。 (3)運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)FcDFR職編碼蛋白FcDFR的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)進(jìn)行了分析，F(xiàn)cDFR富含疏水氨基酸，在N端存在一個(gè)NADP結(jié)合位點(diǎn)“VTGAsGFVGSWL、嘁LEHGY

8、”，還存在一個(gè)底物結(jié)合特異性決定的氨基酸基序“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”，推測(cè)它可能以DHQ或DHK為底物催化生成無色翠雀素和無色天竺葵素。它沒有信號(hào)肽，可能定位于質(zhì)膜，具有酶的典型三級(jí)結(jié)構(gòu)特征。 (4)構(gòu)建金蕎麥FcDFR基因植物表達(dá)載體pC2301-FcDFR，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將FcDFR基因?qū)霟煵莩勘磉_(dá)。通過報(bào)告基因GUS活性組織化學(xué)染色篩選、PCR檢測(cè)以及RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)FcDF

9、R基因已經(jīng)整合進(jìn)煙草基因組并獲表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草95株。 (5)對(duì)95個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草葉片總黃酮進(jìn)行測(cè)定，在所有檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因煙草中，不同株系的總黃酮含量有一定差異，大部分葉片總黃酮含量都有不同程度的提高，最高可達(dá)對(duì)照的1-8倍，其中有78株顯著增加，表明在這些株系中FcDFR基因得到了有效表達(dá)，促進(jìn)煙草總黃酮的有效積累，這表明FcDFR基因具有生物活性，其超量表達(dá)對(duì)增加葉片中類黃酮的含量作用明顯。17個(gè)株系總黃酮和對(duì)照煙草總黃酮含量沒

10、有顯著差異。 4、FcMYBPl基因的克隆與功能初步分析(1)用RAcE方法篩選文庫采用RAcE結(jié)合cDNA文庫篩選的方法，根據(jù)玉米P基因及Myb轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子R2R3家族的R2、R3保守區(qū)域獲得的同源探針，我們從金蕎麥cDNA文庫中克隆到了一個(gè)長(zhǎng)1159個(gè)核苷酸R2R3類MYB蛋白基因，根據(jù)同源性比對(duì)分析，分離得到的基因可能是金蕎麥類黃酮代謝途徑(花色素和原花色素支路)的調(diào)控基因，命名為FcMYBPl(登錄號(hào)：EF522147)

11、。與FcMYBPl蛋白同源性最高的是AAY51377(矮牽牛PH4，61％)，AAX51291(葡萄MYB5b，55％)，AF336278(棉花BNLGHi233，66％)，AAS68190(葡萄的MYB5a，61％)和CAJ90831(葡萄的MYBPAl，76％)。 (2)FcMYBPl基因有一個(gè)K81bp的內(nèi)含子，有1個(gè)111bp的5’-UTR區(qū)、1個(gè)250bp的3，-UTR區(qū)及一個(gè)798個(gè)核苷酸的開放閱讀框，編碼一個(gè)長(zhǎng)265個(gè)氨基

12、酸的蛋白質(zhì)。通過Southem雜交分析，推測(cè)在金養(yǎng)麥基因組FcMYBPl基因可能有1-2個(gè)拷貝。 (3)運(yùn)用生物信息學(xué)手段對(duì)FcMYBPl編碼蛋白FcMYBPl的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與性質(zhì)進(jìn)行了分析。在EGeneBankdP對(duì)FcMYBPl蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域搜索和同源性分析，F(xiàn)cMYBPl氨基酸序列在N端存在保守的R2R3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在C-端同源性低。在FcMYBPl的R2R3N中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)和 bHLH(basic helix-loop-

13、helix，bHLH，堿性螺旋-環(huán)-螺旋)轉(zhuǎn)錄因子相互作用的結(jié)構(gòu)域： FcMYBPl、VvMYB5a、PH4和HAtMYB5的C端有兩段保守序列：Cl(130-138AA)，C2(214-229AA)；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明FcMYBPl和葡萄的VvMYB5a、矮牽牛PH4和擬南芥AtMYB5聚為一支。推測(cè)FcMYBPl和bHLH共同作用在類黃酮甚至苯丙氨酸代謝途徑中起調(diào)控作用。 (4)構(gòu)建金蕎麥FcMYBPl基因植物表達(dá)載體pc23

14、01-FcMYBPl，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將FcMYBPl基因?qū)霟煵莩勘磉_(dá)。通過抗性篩選、報(bào)告基因GUS活性組織化學(xué)染色篩選、PCR檢測(cè)以及RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)FcMYBPl基因已經(jīng)整合進(jìn)煙草基因組并獲表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草80株。 (5)在80個(gè)轉(zhuǎn)基因單株中，隨機(jī)選擇32個(gè)株系用于葉片總黃酮含量的檢測(cè)，不同轉(zhuǎn)基因株系的葉片總黃酮含量相差較大，其中有20株顯著增加，最高為對(duì)照的3.2倍，8株變化差異不顯著，4株顯著下降。即有75