蕎麥黃酮代謝合成相關基因的克隆及分析.pdf

1、蕎麥是重要的醫(yī)食同源作物，隨著人們生活水平不斷的完善，蕎麥的營養(yǎng)價值和藥用價值越來越引起人們的注意。蕎麥不僅營養(yǎng)豐富，其中還含有大量的黃酮類化合物(flavonoids)?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明，養(yǎng)麥具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種藥理活性，而發(fā)揮這些藥理活性的物質(zhì)主要是養(yǎng)麥中所含有的黃酮類化合物。測定結果發(fā)現(xiàn)，蕎麥的的根、芽、苗富含黃酮，具有很好的藥用價值，是糖尿病人、冠心病人等的最佳食品。隨著蕎麥藥用價值更深層次的發(fā)掘研究，蕎麥特

2、別是苦蕎已成為人們研究關注的焦點。目前研究蕎麥黃酮主要集中在通過栽培措施提高黃酮含量，應用基因工程手段研究其分子機理的較少。本實驗利用基因工程方法克隆蕎麥黃酮合成相關的幾個基因，并對目的基因進行了初步的生物信息學分析，旨為進一步研究蕎麥黃酮相關酶基因的功能驗證及表達調(diào)控機理奠定理論基礎。 本研究采用PCR、RT-PCR方法克隆蕎麥黃酮代謝合成相關的3個酶基因，利用生物信息學分析比較，得出如下主要結果： 1.采用PCR、R

3、T-PCR方法克隆得到苦蕎和甜蕎CHS基因DNA、cDNA片段，分別命名為FtCHS、FeCHS、FtrCHS和FerCHS，長度均為1027bp，均包含編碼326個氨基酸的閱讀框。序列分析表明，這四個基因均與其它植物的CHS蛋白基因有很高的同源性。分析該苦蕎和甜蕎的CHS基因片段發(fā)現(xiàn)，其不含內(nèi)含子。比較FtCHS、FcCHS發(fā)現(xiàn)，苦養(yǎng)和甜蕎的CHS基因有38處單堿基差異，我們推測這個可能是導致苦蕎與甜蕎黃酮含量差異的原因之一。

4、 2.采用RT-PCR方法克隆得到4個苦蕎PAL，基因的cDNA片段，命名為FtPAL1、FtPAL12、FtPAL3、FtPALA。其中FtPAL1、FtPAL2、FtPAL3是同一對引物擴增得到的，長度為969bp，它們的核苷酸序列相差很大，分析它們編碼的氨基酸序列也有較大的差異，經(jīng)在線比對分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tPAL1、FtPAL2，F(xiàn)tPA13均與其它植物PAL蛋白基因有很高的同源性，我們推測FtPA1、FtPAL2、FtPAL3是苦蕎

5、PAL，基因家族的3個成員。FtPAIA是根據(jù)FtPAL2與同源性高的植物設計引物擴增得到的，長度為934bp，是FtPAL2的3’段的延伸。拼接FtPAL4與FtPAL2得到一條長為1510bp DNA片段，命名為FtPAL，包含一個編碼503個氨基酸殘基的閱讀框。序列分析表明FtPAL，與其它植物PAL，基因有很高的同源性，蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析推測FtPAL編碼蛋白是一個穩(wěn)定的蛋白。 3.采用。RT-PCR方法克隆得到苦

6、蕎DFR基因的eDNA片段，命名為FtDFR，長度為1120bp，包含一個編碼341氨基酸殘基的閱讀框。與金蕎麥DFR基因全長的氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)tDFR編碼的氨基酸與金蕎麥DFR基因全長的氨基酸長度相同，且僅有3個氨基酸殘基差異。比對分析表明FtDFR與其他植物DFR基因有很高的同源性。 分析苦蕎DFR蛋白，其理論相對分子質(zhì)量為38473.1KDa，預測pI值為5.78，理論分式為C1722H2671N455O510S22