漢賽巴爾通體重組外膜蛋白Pap31的研制和抗原性分析.pdf

1、第一部分:
　　【背景目的】:
　　漢賽巴爾通體(Bartonella henselae)是一類氧化酶陰性、營養(yǎng)條件要求苛刻的革蘭氏陰性小桿菌。其所致人類疾病稱為貓抓病(Cat-scratch disease, CSD),目前致病機理尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)漢賽巴爾通體的生長需要氯化高鐵血紅素(hemin),但其自身不能合成hemin。外膜蛋白Pap31為主要的hemin結(jié)合蛋白,通過其與hemin的結(jié)合使?jié)h賽巴爾通體獲得生長必需

2、的鐵元素。此外,研究還發(fā)現(xiàn)Pap31是漢賽巴爾通體表面的黏附因子,通過其黏附于宿主細(xì)胞表面而在相關(guān)的組織定植。這些均提示外膜蛋白Pap31是一重要的致病因子。本文通過對漢賽巴爾通體外膜蛋白基因pap31進行克隆表達,并初步探討其抗原反應(yīng)性,為診斷試劑和疫苗的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　【實驗方法】:
　　1.PCR擴增pap31基因:根據(jù)基因文庫中pap31基因序列設(shè)計上下游引物,引物含有與載體相匹配的酶切位點。以漢賽巴爾通體基

3、因組DNA為模板,采用PCR法擴增pap31基因片段,1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
　　2.構(gòu)建pQE30/pap31重組質(zhì)粒:pap31基因片段和載體質(zhì)粒pQE30經(jīng)雙酶切后用T4 DNA連接酶進行連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌M15,用含氨芐青霉素和卡那霉素的平板篩選陽性菌落,PCR法和雙酶切法對陽性克隆進行鑒定。
　　3.SDS-PAGE檢測重組蛋白:經(jīng)鑒定的重組菌用IPTG誘導(dǎo)后進行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)R250染色

4、,脫色至本底透明后攝影成像。
　　4.Western Blot鑒定重組蛋白的免疫反應(yīng)性:將SDS-PAGE電泳分離的蛋白通過電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜,依次加入一抗、二抗進行反應(yīng),DAB顯色后觀察特異性結(jié)合條帶。
　　5.制備Pap31多克隆抗體:用重組蛋白Pap31按標(biāo)準(zhǔn)程序免疫小鼠,間接免疫熒光法(IFA)檢測其抗體滴度。
　　【結(jié)果】:
　　1.PCR擴增pap31基因:
　　以漢賽巴爾通體基因組DNA為模

5、板,用PCR方法擴增出了一基因片段,其大小約為1000 bp,此擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果相符。
　　2.pQE30/pap31重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定:
　　以PCR和雙酶切方法篩選鑒定pQE30/pap31重組質(zhì)粒,證實目的基因片段已成功的插入載體質(zhì)粒pQE30。
　　3.pQE30/pap31重組質(zhì)粒在大腸桿菌M15中的表達:
　　pQE30/pap31轉(zhuǎn)化的大腸桿菌M15,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后行SDS-PAGE電泳分

6、析,結(jié)果顯示在25 kD與35 kD Marker之間有一特有蛋白帶,其分子量約為31 kD,與預(yù)期的Pap31重組蛋白大小相符。
　　4.Western Blot結(jié)果:
　　DAB顯色發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達的pQE30/pap31轉(zhuǎn)化菌在分子量約31 kD處顯現(xiàn)一免疫印跡帶,而未誘導(dǎo)的pQE30/pap31轉(zhuǎn)化菌、誘導(dǎo)的pQE30轉(zhuǎn)化菌以及未誘導(dǎo)的pQE30轉(zhuǎn)化菌均無此條帶。
　　5.間接免疫熒光法(IFA)檢測Pa

7、p31免疫小鼠血清:
　　用漢賽巴爾通體菌體抗原片對Pap31免疫小鼠血清作間接免疫熒光檢測,5只免疫小鼠的血清效價均為1:5120,用此血清分別與五日熱巴爾通體菌體抗原和貝氏柯克斯體菌體抗原進行反應(yīng),皆為陰性。
　　【結(jié)論】:
　　本實驗成功的構(gòu)建了pQE30/pap31重組質(zhì)粒, SDS-PAGE電泳證實重組質(zhì)粒pQE30/pap31能夠在大腸桿菌M15中成功表達外膜蛋白Pap31,間接免疫熒光法表明此重組蛋白具有

8、良好的抗原性和漢賽巴爾通體的抗原特異性,免疫印跡法證實此重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。以上結(jié)果提示重組蛋白Pap31可作為研制漢賽巴爾通體感染的新型血清學(xué)診斷試劑和預(yù)防疫苗的候選抗原分子。
　　第二部分:
　　【背景目的】:
　　五日熱巴爾通體(Bartonella quintana)是一類兼性細(xì)胞內(nèi)生長、營養(yǎng)條件要求苛刻的革蘭氏染色陰性短棒狀小桿菌?？筛腥救祟愐鹨幌盗屑膊?包括五日熱、慢性菌血癥、心內(nèi)膜炎、桿菌性血

9、管瘤病。傳播媒介為虱,人類是目前已知唯一的宿主,目前其致病機理尚不清楚,氯化高鐵血紅素(hemin)是許多革蘭氏陰性菌獲得鐵元素的一種來源,研究發(fā)現(xiàn)已知細(xì)菌體外培養(yǎng),五日熱巴爾通體對hemin有最大需求量,但其自身不能合成hemin。外膜蛋白HbpA為主要的hemin結(jié)合蛋白,通過其與hemin的結(jié)合使?jié)h賽巴爾通體獲得生長必需的鐵。體外研究還發(fā)現(xiàn)外膜蛋白HbpA抗體可以抑制五日熱巴爾通體與hemin的結(jié)合能力,并呈劑量依賴性。以上均提示

10、外膜蛋白HbpA是一重要的致病因子。本研究通過對五日熱巴爾通體外膜蛋白基因hbpA進行克隆表達,并初步探討其抗原反應(yīng)性,為診斷試劑和疫苗的開發(fā)提供理論依據(jù)。
　　【實驗方法】:
　　根據(jù)基因文庫中hbpA基因序列設(shè)計引物,采用PCR方法從漢賽巴爾通體基因組中擴增hbpA基因,再將擴增到的hbpA基因?qū)朐吮磉_質(zhì)粒pET32a(+),用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,使hbpA基因在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)高效表達,產(chǎn)生重組外膜蛋白H

11、bpA。用該重組蛋白HbpA免疫小鼠,用間接免疫熒光法(IFA)檢測其抗體滴度,Western Blot檢測其抗原性。
　　【結(jié)果】:
　　成功制備五日熱巴爾通體重組外膜蛋白HbpA。研究證明該重組蛋白具有良好的抗原性,用它免疫小鼠能刺激小鼠產(chǎn)生高效價的特異性抗體,在免疫印跡分析中它能與HbpA免疫小鼠血清發(fā)生強烈反應(yīng)。另外,在間接免疫熒光分析中,重組HbpA蛋白免疫血清能特異識別五日熱巴爾通體,HbpA抗原與漢賽巴爾通體菌