褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)三種細(xì)胞系的建立、病毒敏感性以及環(huán)境污染物對其毒性作用的研究.pdf

1、近年來，環(huán)境污染的日益加劇和各種病毒性疾病的大規(guī)模爆發(fā)，給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為查清魚類病毒的感染途徑和感染機(jī)理并從根本上解決魚類病毒病，魚類細(xì)胞系被廣泛應(yīng)用于病毒的分離繁殖、疫苗研制及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)理等研究。另外，對海洋中各種環(huán)境污染物的檢測缺乏快速靈敏有效的毒性檢測體系，利用魚類細(xì)胞系可有效地對環(huán)境污染物的毒性作用進(jìn)行評價(jià)，確定環(huán)境污染物對海洋魚類產(chǎn)生影響的最低濃度并篩選出合適的生物檢測指標(biāo)，從而與理化檢測手

2、段相結(jié)合，最終建立快速靈敏有效的環(huán)境污染物毒性檢測體系。但目前已建立的魚類細(xì)胞系大多來源于淡水和江海洄游性魚類，其中多數(shù)細(xì)胞系對海水魚類病毒不敏感，而海水魚類細(xì)胞系數(shù)量不多，可用于魚類病毒的分離鑒定及體外繁殖及環(huán)境污染物的毒性研究及其檢測的海水魚類細(xì)胞系更少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對海水魚類病毒病診斷防治和海洋中各種環(huán)境污染物檢測的需求。 褐點(diǎn)石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)隸屬于硬骨魚綱、鱸形目、鮨科、石斑魚

3、屬，是我國重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚種之一，同樣面臨環(huán)境污染和病毒性疾病的嚴(yán)重影響，但至今仍未有成功建立褐點(diǎn)石斑魚組織細(xì)胞系的相關(guān)報(bào)道。因此，迫切需要建立褐點(diǎn)石斑魚細(xì)胞系并應(yīng)用于魚類病毒疫苗研制和環(huán)境污染物毒性作用評價(jià)和檢測等方面，為魚類病毒學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)等研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 為了建立褐點(diǎn)石斑魚細(xì)胞系，本文采用0.5％透明質(zhì)酸酶和0.2％Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法啟動了鰭組織的原代培養(yǎng)，采用0.125％胰蛋白酶消化法啟動了心臟組織的原代培

4、養(yǎng)，不使用酶消化而僅用組織塊培養(yǎng)法啟動了鰾組織原代培養(yǎng)。將三種組織培養(yǎng)在24℃，添加有100μg/mL羧甲基殼寡糖、10ng/mL堿性成纖維樣生長因子和40ng/mLⅠ型胰島素樣生長因子的20％胎牛血清(FBS)-DMEM/F-12培養(yǎng)基(pH7.2)中，原代啟動7天后分別有細(xì)胞遷出，三種細(xì)胞均為成纖維樣細(xì)胞，生長分裂旺盛，22天內(nèi)三種細(xì)胞均長成單層，并能穩(wěn)定連續(xù)傳代。細(xì)胞生長曲線顯示，第60代的褐點(diǎn)石斑魚鰭、心臟和鰾細(xì)胞的群體倍增時(shí)間

5、分別為50.6 h，40.3h和43.3h。染色體數(shù)目與核型分析顯示，第60代褐點(diǎn)石斑魚三種細(xì)胞的特征染色體數(shù)目仍為48條，染色體數(shù)目和核型特征確定其為褐點(diǎn)石斑魚細(xì)胞。目前，鰭細(xì)胞已傳至第90代，心臟細(xì)胞已傳至第70代，鰾細(xì)胞已傳至第75代，已成功建立褐點(diǎn)石斑魚鰭、心臟和鰾三種連續(xù)性細(xì)胞系，將分別利用三種細(xì)胞系進(jìn)行魚類病毒敏感性和環(huán)境污染物毒性作用評價(jià)方面的應(yīng)用研究。 為了研究褐點(diǎn)石斑魚心臟細(xì)胞系對魚類病毒的敏感性及其體外繁殖病

6、毒的能力，本文利用實(shí)驗(yàn)室先前提取并鑒定的兩種海水魚虹彩病毒：大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)和淋巴囊腫病毒(LCDV)，分別感染褐點(diǎn)石斑魚心臟細(xì)胞系細(xì)胞。兩種病毒分別加入心臟細(xì)胞中吸附2h后，于24℃，10％FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2-3天后，心臟細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，TRBIV感染的心臟細(xì)胞還出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化和顆?；F(xiàn)象。利用透射電鏡可觀察到大量典型的TRBIV或LCDV病毒粒子在心臟細(xì)胞質(zhì)中聚集并增

7、殖，病毒粒子大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)分別與已有報(bào)道一致。CPE大于70％后收獲心臟細(xì)胞后，采用凍融1次，高速冷凍離心的方法得到利用褐點(diǎn)石斑魚心臟細(xì)胞系繁殖的TRBIV或LCDV病毒液。測得TRBIV和LCDV的病毒液滴度較高，分別為104.5 TCID50 ml-1叫和104.0 TCID50 ml-1，且可繼續(xù)感染其他正常心臟細(xì)胞系細(xì)胞。以上結(jié)果說明，褐點(diǎn)石斑魚心臟細(xì)胞系對兩種魚類虹彩病毒TRBIV和LCDV較為敏感，在目前的體外病毒繁殖條件下

8、可繁殖獲得滴度較高的兩種病毒液，褐點(diǎn)石斑魚心臟細(xì)胞系是TRBIV和LCDV良好的體外繁殖體系。 為了利用褐點(diǎn)石斑魚鰾細(xì)胞系研究久效磷對鰾細(xì)胞的毒性作用和致毒機(jī)理，并對久效磷的毒性作用進(jìn)行評價(jià)以應(yīng)用于環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥污染檢測，本文使用不同濃度久效磷處理褐點(diǎn)石斑魚鰾細(xì)胞系細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)1μg/mL久效磷即可對鰾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，且呈濃度依賴性。利用MTT法和細(xì)胞蛋白含量測定法所得的久效磷對鰾細(xì)胞的48h細(xì)胞半數(shù)抑制濃度(48h-IC5

9、0)分別為30.64和31.44μg/mL。在細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，久效磷處理鰾細(xì)胞72h后，細(xì)胞開始出現(xiàn)變圓脫落現(xiàn)象并隨后大量死亡。電鏡結(jié)果顯示久效磷主要引起鰾細(xì)胞線粒體的嚴(yán)重?fù)p傷。隨著久效磷濃度的增加，鰾細(xì)胞線粒體出現(xiàn)腫脹，內(nèi)嵴模糊并最終溶解等現(xiàn)象。細(xì)胞生物標(biāo)志酶活性變化結(jié)果顯示，久效磷可引起鰾細(xì)胞乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的顯著變化。根據(jù)細(xì)胞病理學(xué)及酶學(xué)方面的變化，本文推測久

10、效磷的致毒機(jī)理是引起細(xì)胞內(nèi)解毒和抗氧化防御系統(tǒng)的損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)線粒體的產(chǎn)能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。以上結(jié)果顯示褐點(diǎn)石斑魚鰾細(xì)胞系細(xì)胞對久效磷的毒性作用靈敏度高，檢測其毒性需要的時(shí)間較短，且鰾細(xì)胞的AChE、SOD和GST三種酶活性可作為久效磷的生物檢測指標(biāo)，為最終與理化檢測手段相結(jié)合，建立快速靈敏有效的有機(jī)磷污染物生物檢測體系奠定基礎(chǔ)。 為了利用褐點(diǎn)石斑魚鰭細(xì)胞系對三丁基氧化錫(TBTO)的毒性作用進(jìn)行評價(jià)，研究TBTO對鰭細(xì)

11、胞的毒性作用和致毒機(jī)理，本文利用不同濃度的TBTO處理褐點(diǎn)石斑魚鰭細(xì)胞系細(xì)胞，通過MTT法和細(xì)胞蛋白含量測定法檢測了TBTO對鰭細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。由結(jié)果可知，1ng/mL TBTO即可對鰭細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性隨著TBTO濃度的增加而增大，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。利用上述兩種方法所得的TBTO對鰭細(xì)胞的48h-IC50值分別為39.87和41.77ng/mL。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)TBTO處理鰭細(xì)胞120h內(nèi)細(xì)胞形態(tài)和貼壁能力與對照組相比

12、均沒有明顯可見的改變。而電鏡結(jié)果則顯示TBTO主要引起鰭細(xì)胞線粒體的嚴(yán)重?fù)p傷，線粒體出現(xiàn)腫脹，內(nèi)嵴模糊并最終溶解的現(xiàn)象，并在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。鰭細(xì)胞生物標(biāo)志酶活性變化結(jié)果顯示，TBTO可引起鰭細(xì)胞SOD和GST活性的顯著變化，鰭細(xì)胞的SOD和GST酶活性可作為TBTO的生物檢測指標(biāo)，為最終與理化檢測手段相結(jié)合，建立快速靈敏有效且符合國家標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)錫污染物生物檢測體系奠定基礎(chǔ)。 本文旨在建立褐點(diǎn)石斑魚鰭、心臟和鰾細(xì)胞系，并將三種