PPARγ保護(hù)原代皮層神經(jīng)元過氧化氫損傷的研究.pdf

1、目的：
　　觀察過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元損傷中，過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR?）的表達(dá)及活性改變，以及PPAR激活或抑制對(duì)神經(jīng)元過氧化氫損傷產(chǎn)生的影響，探討PPAR對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1、原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元：取出生24h之內(nèi)Sprague-Dawley新生鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行體外原代培養(yǎng)，培養(yǎng)7天（d7）進(jìn)行純度鑒定，并用于各種處理和檢測(cè)。
　　2

2、、神經(jīng)元過氧化氫損傷模型：以不同濃度的過氧化氫作用于d7神經(jīng)元，于不同作用時(shí)間后進(jìn)行評(píng)價(jià)，選取合適濃度及作用時(shí)間應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：包括光鏡下觀察，即將不同組別細(xì)胞置于將倒置相差顯微鏡下，觀察其形態(tài)變化，并采集圖像；神經(jīng)元MAP2免疫熒光染色，即用MAP2抗體標(biāo)記神經(jīng)元，熒光顯微鏡下觀察不同組別細(xì)胞形態(tài)完整性的改變，并采集圖像。
　　4、MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率，即檢測(cè)不同組別神經(jīng)元經(jīng)處理后細(xì)胞活

3、性的改變。
　　5、分別提取總蛋白和核蛋白，Western blotting法檢測(cè)不同組別細(xì)胞內(nèi)PPARγ、p-PPARγ（磷酸化 PPARγ）、p-ERK1/2（磷酸化 ERK1/2，即 ERK1/2的活性形式）、Bcl-2、活化的Caspase-3、Nrf2的表達(dá)水平。
　　6、qRT-PCR法觀察 PPARγ靶基因：提取不同組別神經(jīng)元 RNA，qRT-PCR技術(shù)對(duì)PPARγ靶基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　7、ELI

4、SA法檢測(cè)PPARγ-DNA結(jié)合活性：應(yīng)用PPARγ轉(zhuǎn)錄因子分析試劑盒檢測(cè)不同組別神經(jīng)元 PPARγ與過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（PPRE）的結(jié)合活性。
　　8、反義寡核苷酸法降低神經(jīng)元PPARγ：用PPARγ反義寡核苷酸處理原代培養(yǎng)d7神經(jīng)元細(xì)胞，抑制PPARγ表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、體外培養(yǎng)正常皮層神經(jīng)元2d后，大多細(xì)胞呈圓形或橢圓形，可見較細(xì)小的細(xì)胞突起，至第7天時(shí)神經(jīng)元胞體立體感強(qiáng)，形態(tài)飽滿，突起變長(zhǎng)且

5、增粗，并相互交織成網(wǎng)。用神經(jīng)元特異性抗體微管相關(guān)蛋白2（MAP2）對(duì)進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定神經(jīng)元陽性率達(dá)95％以上，是相對(duì)純的神經(jīng)元培養(yǎng)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、將過氧化氫作用于神經(jīng)元，可造成神經(jīng)元損傷，輕者細(xì)胞腫脹變圓，細(xì)胞突起斷裂或消失；重者細(xì)胞發(fā)生崩解，可見較多細(xì)胞碎片，并呈現(xiàn)劑量-時(shí)程依賴效應(yīng)。選取濃度為500?M、作用6~24小時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3、過氧化氫抑制神經(jīng)元PPAR?蛋白表達(dá)，同時(shí)增加PPAR?滅活

6、；抑制ERK1/2激活可以拮抗過氧化氫對(duì)PPAR?的滅活作用。
　　4、外源性給予PPAR?激動(dòng)劑羅格列酮減輕神經(jīng)元過氧化氫損傷、增加Bcl-2及Nrf2表達(dá)，同時(shí)抑制活化的Caspase-3表達(dá)；而PPAR?抑制劑GW9662可以拮抗羅格列酮的保護(hù)作用、降低Bcl-2及Nrf2表達(dá)、增加活化的Caspase-3表達(dá)。
　　5、降低PPAR?表達(dá)，對(duì)正?；A(chǔ)狀態(tài)下的神經(jīng)元形態(tài)和存活率無明顯影響，但使神經(jīng)元對(duì)過氧化氫損傷更敏感

7、，增加過氧化氫誘導(dǎo)的Bcl-2、Nrf2、活化的Caspase-3表達(dá)的改變，同時(shí)可以降低外源性給予PPAR?激動(dòng)劑羅格列酮所產(chǎn)生的保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1、在體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中，過氧化氫可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)PPAR?（即表達(dá)下調(diào)和活性降低）引起神經(jīng)元損傷。
　　2、在體外原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中，外源性激活PPARγ可以保護(hù)神經(jīng)元過氧化氫損傷，而神經(jīng)元自身PPARγ的表達(dá)可能是神經(jīng)元自我保護(hù)機(jī)制之一。