PPARγ在腦缺血再灌注損傷和過氧化氫損傷中的調控機制研究.pdf

1、研究目的:
　　1.建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型(in vivo),觀察12/15-脂氧酶產物12s-羥基二十四碳四烯酸(12s-hydroxyeicosatetraenoic,12s-HETE)對腦組織PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorsg)表達及活性的影響,以及對炎癥的抑制作用,并初步探討12/15-脂氧酶(12/15-lipoxygenase,12/15-LOX)

2、途徑在缺血腦組織中調控PPARγ的意義。2.建立體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經元氧糖剝奪(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)損傷模型(in vitro),觀察體外原代培養(yǎng)皮層神經元在OGD損傷后,細胞內12/15-脂氧酶、PPARγ的蛋白表達及活性變化;并多方法抑制12/15-脂氧酶或外源性給予12/15-脂氧酶產物(12s-HETE),觀察對OGD神經元中PPARγ及其活性(靶基因表達、DNA結合活性等)的影響,

3、進而確定OGD神經元中12/15-脂氧酶途徑對PPARγ的調控作用。3.建立體外原代培養(yǎng)皮層神經元過氧化氫損傷模型,觀察過氧化氫損傷神經元內ERK1/2表達及激活、PPARγ表達、磷酸化修飾及活性變化;抑制ERK1/2激活對PPARγ的影響;以確定過氧化氫損傷神經元中ERK1/2途徑對PPARγ的調節(jié)作用。
　　研究方法：
　　1.將大鼠隨機分為假手術組、缺血再灌注模型組、12s-HETE干預組。采用神經功能缺損評分、TTC

4、染色評估12s-HETE對腦缺血再灌注(缺血60min/再灌注24小時）大鼠的損傷程度、梗死體積的影響；免疫組化、western blot技術檢測PPARγ、iNOS、活化Caspase3等的表達和活性。2.自孕18-21d SD雌性大鼠，進行胎鼠大腦皮層神經元原代體外培養(yǎng)。至7d于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)，以免疫熒光染色法對神經元進行純度鑒定（MAP2表達）。建立氧糖剝奪再灌注損傷模型，倒置相差顯微鏡觀察不同OGD損傷組細胞形

5、態(tài)變化、MTT法測定細胞相對存活率。神經元隨機分組為對照組和OGD損傷60min組、90min組和120min組（再灌注時間均為24小時）。分別提取總蛋白、漿蛋白和核蛋白，利用western blot、免疫熒光技術檢測各組神經元中12/15-脂氧酶和PPARγ各成分蛋白表達的改變。依據實驗結果選取90min組神經元作為OGD損傷組，同時應用12/15-脂氧酶抑制劑或反義寡聚核苷酸抑制、給予12/15-脂氧酶產物12s-HETE等多方法干

6、預，對細胞中12/15-脂氧酶及PPARγ總蛋白、胞漿蛋白、胞核蛋白水平進行檢測，并進行 PPARγ的亞細胞表達定位；RT-PCR法檢測PPARγ靶基因（脂蛋白脂酶和乙酰輔酶A氧化酶）mRNA表達；構建pGL3-PPRE質粒，轉染體外正常培養(yǎng)的皮層神經元細胞，熒光素酶含量檢測12s-HETE對PPAR?-DNA結合活性的影響。3.原代培養(yǎng)皮層神經元，隨機分組為對照組和過氧化氫損傷組，MTT法觀察神經元損傷以確定過氧化氫作用濃度。進行ER

7、K1/2、phospho-ERK1/2、PPARγ和phospho-PPARγ蛋白水平表達的時程研究，同時對PPARγ的核移位和亞細胞定位進行檢測；應用多種ERK1/2激活抑制劑，檢測對過氧化氫損傷神經元內PPARγ表達和活性的影響。
　　實驗結果：
　　1.與假手術組相比較，缺血再灌注損傷組大鼠神經功能缺損評分顯著增加，平均腦梗死體積為30.24％；腦組織內 PPARγ總蛋白表達水平明顯增高，胞漿PPARγ蛋白顯著下降、胞

8、核PPARγ蛋白顯著增加；iNOS（NOS2）表達水平顯著增高，活化caspase3表達水平顯著增高。與缺血再灌注組相比較，12s-HETE干預使大鼠神經功能缺損評分降低，腦梗死體積明顯縮小；PPARγ總蛋白表達水平進一步增高，胞漿PPARγ蛋白進一步下降、胞核PPARγ蛋白進一步增加；同時使iNOS表達水平顯著下降，活化caspase3表達水平顯著下降。
　　2.體外原代培養(yǎng)7d的大鼠皮層神經元，形態(tài)飽滿，突起豐富，相互交織成網

9、絡，神經元 MAP2陽性率＞95%，可視為比較純的神經元培養(yǎng)。體外原代培養(yǎng)7d大鼠皮層神經元，OGD損傷60min、90min和120min（再灌注24小時），光鏡下形態(tài)學均出現損傷性改變；MTT法測定神經元細胞相對存活率降低，分別為61.34±3.14%、43.84±2.07%、15.18±2.32%。Western blot和免疫熒光檢測顯示：與正常對照組神經元相比較，OGD損傷組神經元PPARγ總蛋白表達顯著增加，胞漿PPARγ顯

10、著下降、胞核PPARγ顯著增加；12/15-LOX蛋白表達顯著增加。與OGD損傷組神經元相比較，12/15-LOX抑制劑 Baicalein(5μM、10μM)或12/15-LOX反義寡聚核苷酸處理組神經元，12/15-LOX和PPARγ蛋白水平均有顯著下降，胞漿PPARγ輕度或顯著增加、胞核PPARγ顯著下降。RT-PCR法檢測：與OGD損傷組相比，12s-HETE處理使神經元內PPARγ靶基因脂蛋白脂酶和乙酰輔酶A氧化酶mRNA水平

11、顯著增加。pGL3-PPRE質粒轉染正常培養(yǎng)的神經元細胞，12s-HETE處理使熒光素酶活性明顯增加。
　　3.體外原代培養(yǎng)皮層神經元，進行過氧化氫（50μM、200μM、500μM）處理。光鏡下觀察：過氧化氫50μM處理組神經元損傷較輕，過氧化氫500μM處理組神經元損傷最為顯著，但神經元死亡過多；MTT法計算神經元相對存活率分別為過氧化氫50μM組75.25±3.31%、200μM組53.84±2.42%、500μM組21.1

12、8±1.33%，選用過氧化氫200μM作為后續(xù)實驗處理濃度。Western blot檢測顯示：過氧化氫處理0~24h神經元ERK1/2總蛋白無顯著變化，phospho-ERK1/2于過氧化氫處理約0.5h~3h內顯著上調，之后迅速下降至基礎表達水平；PPARγ總蛋白在過氧化氫處理0~3h神經元中表達無顯著變化，6h~24h顯著下降；phospho-PPARγ于過氧化氫處理約0.5h~3h時顯著上調，之后開始下降，但6h組仍高于0h組，1

13、2h~24h蛋白表達水平顯著降低。核移位檢測顯示：與正常對照組神經元（0h組）相比較，過氧化氫損傷0.5h、3h組神經元PPARγ胞漿蛋白水平均顯著上升，同時胞核蛋白水平均顯著下降。與過氧化氫處理組相比較，ERK1/2抑制劑 U0126或 PD98059處理組神經元 phospho-ERK1/2和phospho-PPARγ蛋白水平均顯著下降，神經元 PPARγ胞漿蛋白水平減少、胞核蛋白水平顯著增加。
　　研究結論：
　　1.

14、12/15-LOX產物12s-HETE促進缺血再灌注損傷大鼠腦組織PPAR?的表達和核移位，同時抑制缺血再灌注損傷腦組織中炎性介質的產生和促凋亡因子表達，具有腦保護作用。初步推測，12s-HETE的這種腦保護作用可能是通過對PPAR?的激活實現的。進一步推測在缺血再灌注損傷腦組織中，可能存在12/15-LOX途徑對PPARγ的激活調控作用。
　　2.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經元 OGD損傷誘導神經元12/15-LOX和PPARγ表達

15、上調及活性增加；12/15-LOX選擇性抑制劑和反義寡聚核苷酸可顯著抑制OGD誘導的12/15-LOX和PPARγ改變；12/15-LOX產物12s-HETE可顯著上調OGD誘導的12/15-LOX和PPARγ改變，同時增加PPARγ轉錄活性。推測在體外原代培養(yǎng)皮層神經元 OGD損傷中，存在12/15-LOX途徑對 PPARγ的激活調控作用。
　　3.體外原代培養(yǎng)大鼠皮層神經元，過氧化氫引起 PPARγ磷酸化修飾和PPARγ表達下