CCNH-CDK7協(xié)同CtBP2促進(jìn)食管鱗癌的侵襲及轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的：
　　明確Cyclin H/Cyclin-dependent kinase7(CCNH/CDK7)復(fù)合物通過與CtBP2相互作用在調(diào)控食管鱗形細(xì)胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma，ESCC）細(xì)胞侵襲和遷移過程中的意義
　　第一部分：
　　1．在組織水平，采用免疫組化方法（Envision法）檢測105例ESCC石蠟切片中CCNH、CDK7、CtBP2及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epit

2、helial-Mesenchymal Transition，EMT）標(biāo)志物E鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)分析上述指標(biāo)的表達(dá)相關(guān)性，并結(jié)合臨床病理資料分析CCNH、CDK7、CtBP2的表達(dá)分別與ESCC組織的病理分級、腫瘤大小、浸潤深度、腫瘤轉(zhuǎn)移等因素的相關(guān)性。
　　2．結(jié)合隨訪資料，采用單因素和 Kaplan-Meier法分析 ESCC中CCNH/CDK7、CtBP2的表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系，采用Cox危險比例模

3、型多因素分析CCNH/CDK7、CtBP2與ESCC預(yù)后的關(guān)系。
　　第二部分：
　　1.在食管癌細(xì)胞中利用Western Blot檢測CCNH/CDK7與CtBP2的表達(dá)，并利用免疫共沉淀檢測上述分子的相互作用。
　　2.在食管癌細(xì)胞株ECA109中利用干擾質(zhì)粒及全長表達(dá)載體分別干預(yù)CCNH、CDK7的表達(dá)，Western Blot檢測上述分子表達(dá)對CtBP2表達(dá)的影響，并利用免疫共沉淀檢測干預(yù)CCNH或CDK7表達(dá)

4、后，對其復(fù)合物與CtBP2相互作用的影響。
　　3．在食管癌細(xì)胞株 ECA109及 TE-1中利用干擾質(zhì)粒及全長表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)CtBP2的表達(dá)，檢測其表達(dá)對細(xì)胞EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白水平的影響，并檢測其表達(dá)對細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。
　　4．在食管癌細(xì)胞株ECA109及TE-1分別干擾CCNH表達(dá)或干擾其表達(dá)后回補 CtBP2，檢測上述改變對食管癌細(xì)胞 EMT標(biāo)志物 E-

5、cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平的影響；并在食管癌細(xì)胞中分別過表達(dá)CCNH或過表達(dá)CCNH后干擾CtBP2表達(dá)，檢測上述改變對EMT標(biāo)志物表達(dá)水平的影響；結(jié)合劃痕實驗及transwell實驗驗證上述干預(yù)手段對細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．免疫組化結(jié)果顯示，CCNH、CDK7和CtBP2在正常食管組織中低表達(dá)，在食管鱗癌組織中高表達(dá)，其陽性表達(dá)率與腫瘤組織的病理學(xué)分級（P=0.

6、000）﹑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況（P=0.005）正相關(guān)。相關(guān)性分析顯示，食管鱗癌組織中CCNH、CDK7和CtBP2表達(dá)水平與EMT指標(biāo)E-cadherin的表達(dá)水平正相關(guān)（P=0.004），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kaplan-Meier分析顯示，ESCC組織中CCNH、CDK7、CtBP2高表達(dá)的病例，其生存率顯著低于上述分子低表達(dá)的病例，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。單因素分析表明CCNH、CDK7及CtBP2的表達(dá)水平與ESCC患者的不良預(yù)后有關(guān)（P=

7、0.010）。Cox危險比例模型分析顯示CCNH、CDK7及CtBP2可做為ESCC預(yù)后的獨立指標(biāo)（P=0.005）。
　　2．免疫組化結(jié)果顯示食管癌細(xì)胞中CCNH/CDK7復(fù)合物與CtBP2存在著相關(guān)性。在食管癌細(xì)胞中，通過內(nèi)源性免疫共沉淀和外源性免疫共沉淀進(jìn)一步驗證上述的相互作用。
　　3．在食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染過表達(dá)CtBP2質(zhì)粒，Western blot方法和免疫熒光結(jié)果顯示轉(zhuǎn)載CtBP2過表達(dá)可以導(dǎo)致E-cadheri

8、n水平表達(dá)下降；在食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染干擾性CtBP2質(zhì)粒，E-cadherin蛋白水平較對照組顯著增加。劃痕實驗結(jié)果表明，CtBP2高表達(dá)的ESCC細(xì)胞其遷移能力明顯強(qiáng)于對照組細(xì)胞，而CtBP2低表達(dá)的ESCC細(xì)胞其遷移能力低于對照組細(xì)胞。Transwell實驗得到了同樣的結(jié)果
　　4．在食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染干擾性CCNH質(zhì)粒，Western blot方法和免疫熒光結(jié)果顯示 E-cadherin蛋白表達(dá)水平較空白對照組增加；在干擾 CC

9、NH表達(dá)后回補CtBP2過表達(dá)質(zhì)粒，則一定程度上抑制了E-cadherin水平的上調(diào)；食管癌細(xì)胞中過表達(dá)CCNH質(zhì)粒，E-cadherin蛋白表達(dá)水平較對照組減少，而過表達(dá)CCNH后再導(dǎo)入CtBP2干擾性質(zhì)粒，則可以上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)水平。上述實驗結(jié)果提示CCNH可通過與CtBP2的作用促進(jìn)食管癌細(xì)胞EMT的進(jìn)程，劃痕實驗和Trans well實驗結(jié)果也進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論。
　　結(jié)論：
　　1．在組織學(xué)水平發(fā)

10、現(xiàn)CCNH/CDK7、CtBP2在食管癌組織中高表達(dá)，與ESCC患者的不良預(yù)后有密切關(guān)系，提示CCNH/CDK7、CtBP2可能與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為ESCC預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　2．明確了 CCNH/CDK7與 CtBP2在食管癌細(xì)胞中存在協(xié)同作用，CCNH/CDK7在ESCC細(xì)胞中可正向調(diào)節(jié)CtBP2的表達(dá)水平。
　　3．CtBP2促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移過程。CCNH/CDK7復(fù)合物通過上調(diào)CtBP2的表達(dá)促