Penicillium freii F63來源的甘露聚糖酶的基因克隆、表達(dá)與酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、β-甘露聚糖酶來源廣泛,包括植物,動物和微生物。微生物是理想的β-甘露聚糖酶來源,基于它們具有較高的酶生產(chǎn)力,且易于培養(yǎng)。迄今為止,只有為數(shù)不多的幾個來源于青霉的β-甘露聚糖酶基因被克隆和表達(dá)。本研究采用基因工程技術(shù)從一株青霉(Penicillium freii F63)菌中克隆一條新穎的耐堿第5家族β-甘露聚糖酶基因,于畢赤酵母 GS115中高效表達(dá)重組酶,達(dá)到電泳純級別,能夠在寬廣的酸堿條件下表現(xiàn)較高的酶活力,并在堿性條件下保持較好

2、的穩(wěn)定性。
　　采用降落PCR方法,使用β-甘露聚糖酶兼并引物(GH5F和GH5R),從青霉(Penicillium freii F63)基因組中克隆獲得一條176 bp的β-甘露聚糖酶基因部分序列。據(jù)此序列設(shè)計兩套特異性引物,采用熱不對稱交錯 PCR方法,獲取已知核酸序列的側(cè)翼未知序列。與核心區(qū)序列比對,并拼接得到一條完整的甘露聚糖酶基因 man5F63全長序列1367 bp。設(shè)計引物 GH56F和 GH56R,從青霉(Peni

3、cillium freii F63)cDNA中克隆出一條大小為1260 bp的目的片段,具有信號肽和成熟蛋白質(zhì)編碼的核酸序列。分析該酶基因 man5F63具有兩個內(nèi)含子分別為55 bp(845→859 bp)和52 bp(1030→1081 bp),預(yù)測信號肽為18 aa(54 bp),成熟甘露聚糖酶Man5F63編碼401 aa,分子量約為43.1 kDa,等電點為5.52,具有典型(β/α)8桶狀折疊結(jié)構(gòu),催化活性位點為Glu246

4、和Glu355。
　　克隆成熟甘露聚糖酶Man5F63的基因,去除信號肽,并于5′和3′兩端分別引入限制性內(nèi)切酶 Spe I和 Not I的酶切位點序列,構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9-man5F63。限制性內(nèi)切酶Dra I線性化該載體后,轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞,篩選出陽性酵母重組子,并完成搖瓶水平表達(dá)。上清液中相關(guān)分析結(jié)果表明酵母重組子高效表達(dá)重組甘露聚糖酶rMan5F63濃度為1.1 g/L,于上清液中達(dá)到電泳純級別,其

5、分子量約為72 kDa,遠(yuǎn)大于其預(yù)測分子量,表明表達(dá)過程中發(fā)生翻譯后修飾。另外高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析該重組酵母的電泳純產(chǎn)品,結(jié)果顯示11條肽鏈與預(yù)測的甘露聚糖酶Man5F63氨基酸序列完全匹配,充分說明該產(chǎn)品為重組甘露聚糖酶rMan5F63。將甘露聚糖酶基因man5F63全長序列遞交NCBI數(shù)據(jù)庫,獲得登錄號為JN882026。
　　重組甘露聚糖酶rMan5F63的最適反應(yīng)pH為4.5,最適反應(yīng)溫度為60°C,且在廣泛的

6、pH范圍4～9內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性,甚至在pH11和12條件下處理后相對酶活力仍保留40％以上。在催化反應(yīng)體系中,MnSO4,CoCl2,CuSO4或β-疏基乙醇(?-mercaptoethanol)的存在能夠顯著增強rMan5F63酶活性,而HgCl2或十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在幾乎完全抑制 rMan5F63酶活性。rMan5F63降解甘露糖含量較高的雜甘露聚糖,傾向于專一性催化水解由甘露糖形成的β-1,4-糖苷鍵。在最適反應(yīng)條件下