B7-H3在兒童支氣管哮喘中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、可溶性B7-H3（sB7-H3）在支氣管哮喘患兒血漿中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：研究支氣管哮喘患兒外周血中可溶性B7-H3（sB7-H3）的表達(dá)水平，并分析其與其他細(xì)胞因子的相關(guān)性，探討sB7-H3在支氣管哮喘中的異常表達(dá)及臨床意義。
　　方法：選取2013年6月～2015年5月在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院呼吸科住院治療并符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的支氣管哮喘患兒23例，及同期住院行外科擇期手術(shù)的患兒14例作為對照組，哮喘組患兒采集

2、住院后24小時(shí)內(nèi)及出院前24小時(shí)內(nèi)的外周血，分為哮喘急性期組和恢復(fù)期組，對照組患兒術(shù)前采外周血。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血漿sB7-H3、IL-4、IFN-γ、IL-17的表達(dá)水平，分析sB7-H3與其他細(xì)胞因子的相關(guān)性。
　　結(jié)果：血漿中sB7-H3和IL-4水平在哮喘急性發(fā)作期組明顯升高，顯著高于恢復(fù)期組和對照組（P=0.049，P<0.001），經(jīng)過治療后72.9％的患兒血漿sB7-H3和87.0%的患兒血漿I

3、L-4水平降低，但總體水平仍高于對照組（P=0.028）；哮喘急性期患兒血漿IFN-γ水平顯著降低，低于恢復(fù)期組和對照組（P=0.018，P=0.001），經(jīng)過治療后，73.9%的患兒血漿IFN-γ水平較急性期升高，但總體水平仍低于對照組（P=0.028）；血漿IL-17在三組患兒之間差異不明顯（P=0.084）。治療前后哮喘患兒血漿sB7-H3和IL-4水平升高和降低情況一致性較好（Kappa=0.596，P=0.002），而和IFN

4、-γ、IL-17的一致性較差（Kappa=-0.232和0.055，P>0.05）。
　　結(jié)論：哮喘患兒體內(nèi)存在Th1/Th2的免疫失衡；sB7-H3在哮喘急性期表達(dá)異常升高；sB7-H3對Th2細(xì)胞可能存在正性調(diào)控作用。
　　第二部分、B7-H3融合蛋白對小鼠哮喘模型作用的研究
　　目的：研究B7-H3融合蛋白在小鼠哮喘模型中的作用；探討B(tài)7-H3在哮喘免疫機(jī)制，特別是Th1/Th2失衡中的地位。
　　方法：采

5、購SPF級的6周齡C57BL/6小黑鼠，隨機(jī)分為三組：生理鹽水對照組（C組）、哮喘組（N組）、哮喘加B7-H3融合蛋白干預(yù)組（NB組）。其中N組和NB組均給予OVA致敏及激發(fā)（0、7、14天給予OVA腹腔注射致敏，22、24、26、28天分別給予OVA半小時(shí)霧化吸入），C組給予同劑量生理鹽水注射和激發(fā)。此外，NB分別在0、3、7、10、14天腹腔注射B7-H3融合蛋白50μg。各組小鼠于末次激發(fā)24小時(shí)后麻醉處死，采集血漿。小鼠進(jìn)行支氣

6、管肺泡灌洗，支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)；采用ELISA法測定小鼠BALF及血漿中的IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的水平；小鼠肺組織切片行HE染色、PAS染色及B7-H3免疫組化，觀察肺組織炎性細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況、氣道粘液分泌情況及肺組織B7-H3表達(dá)情況。
　　結(jié)果：N組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞比例明顯高于C組小鼠（P均為0.004），NB組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性

7、粒細(xì)胞比例最高，顯著高于N組和C組小鼠（P<0.05）；N組小鼠血漿及BALF中IFN-γ較C組降低，而IL-4、IL-5和IL-17較對照組升高（P均<0.05），NB組較N組小鼠血漿及BALF中IFN-γ、IL-4及IL-5均有不同程度的升高，而IL-17則沒有顯著差異（P>0.05）；肺組織病理染色顯示C組小鼠肺組織無明顯炎性細(xì)胞浸潤及粘液分泌，N組小鼠肺組織及氣道周圍可見較多炎性細(xì)胞浸潤，氣道內(nèi)可見紅色酸性粘液分泌亢進(jìn)，而NB組

8、小鼠肺組織及氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤更為明顯，氣道內(nèi)幾乎被酸性粘液堵塞；免疫組化顯示C組小鼠肺組織中幾乎無B7-H3表達(dá)，N組小鼠B7-H3表達(dá)較高，NB組小鼠肺組織中B7-H3表達(dá)最高，顯著高于C組和N組小鼠（P均<0.05）。
　　結(jié)論：B7-H3融合蛋白能夠同時(shí)上調(diào)Th1和Th2型免疫反應(yīng)，加重肺組織的病理改變。
　　第三部分、Toll樣受體2信號對B7-H3作用的影響
　　目的：揭示B7-H3與Toll樣受體2（T

9、LR2）在哮喘模型中的作用及相關(guān)性，進(jìn)一步闡明B7-H3在哮喘模型中參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)的機(jī)制。
　　方法：采購SPF級的6周齡C57BL/6和TLR2-/-小黑鼠，分為五組：生理鹽水對照組（C組）、野生型小鼠哮喘組（N組）、野生型哮喘小鼠加B7-H3融合蛋白干預(yù)組（NB組）、TLR2-/-小鼠哮喘組（T組）和TLR2-/-哮喘小鼠加B7-H3融合蛋白干預(yù)組（TB組）。其中N、NB、T、TB組均給予 OVA致敏及激發(fā)（0、7、14

10、天給予OVA腹腔注射致敏，22、24、26、28天分別給予OVA半小時(shí)霧化吸入），C組給予同劑量生理鹽水注射和激發(fā)。NB和TB組分別在0、3、7、10、14天腹腔注射B7-H3融合蛋白50μg。各組小鼠于末次激發(fā)24小時(shí)后麻醉處死，采集血漿。小鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，BALF進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)；采用ELISA法測定小鼠BALF及血漿中的IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的水平；小鼠肺組織切片行HE染色、PAS染色及B7-H

11、3和NF-κB免疫組化，觀察肺組織炎性細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤情況、氣道粘液分泌情況及肺組織B7-H3和NF-κB表達(dá)情況。
　　結(jié)果：T組小鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)及嗜酸性細(xì)胞比例較C組有所升高（P分別為0.025和0.006），但顯著低于N組（P均為0.004）；而TB組小鼠相比T組小鼠總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性細(xì)胞比例也有顯著升高（P分別為0.006和0.004）；T組相比N組小鼠，血漿及BALF中IL-4、IL-5顯著降低而IFN-γ水平

12、顯著升高（P均<0.05），除BALF中 IFN-γ水平低于C組外（P=0.006），其余均與C組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05）；TB組血漿中IL-4、IL-5及IFN-γ水平較T組均有不同程度升高；肺組織病理染色顯示T組小鼠肺組織及氣管周圍可見炎性細(xì)胞浸潤，但較N組小鼠減輕，氣道內(nèi)可見紅色酸性粘液分泌亢進(jìn)，與N組小鼠相仿，TB組較T組肺組織及氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤變化不明顯，但氣道內(nèi)粘液分泌更為亢進(jìn)，與NB組小鼠相仿；B7-H3免疫組化

13、顯示NB組和TB組小鼠肺組織B7-H3表達(dá)最高，顯著高于其余各組（P均<0.05），其次為N組和T組小鼠，C組小鼠肺組織幾乎未見B7-H3表達(dá)；NF-κB免疫組化顯示C組、T組和TB組小鼠肺組織中NF-κB表達(dá)量相近，顯著低于N組和NB組小鼠（P=0.004）。
　　結(jié)論：TLR2受體與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，阻斷TLR2途徑可以顯著減輕哮喘的臨床癥狀及病理改變；哮喘模型中B7-H3產(chǎn)生作用并不依賴TLR2受體，至少不僅僅依賴TL