N-乙酰半胱氨酸可恢復(fù)TDP-25所致的運動神經(jīng)元樣細胞持續(xù)性鈉通道功能異常.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種選擇性損害上、下運動神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病。本病具有慢性、進行性、致死性的特點。本病的大部分患者是散發(fā)型，約10％患者存在家族性常染色體顯性遺傳史，即為家族型，20％的家族型患者存在銅/鋅超氧化物岐化酶(SOD1)基因突變。目前研究發(fā)現(xiàn)，約3％的家族型患者以及2.9％散發(fā)型患者存在TAR-DNA結(jié)合蛋白43(TDP-43)基因突變，表明ALS的發(fā)病與

2、TDP-43基因突變有著密切的關(guān)系。
　　TDP-43蛋白是一種由定位于chrlp36.2的TARDBP基因編碼的核蛋白，具有結(jié)合單鏈DNA、RNA的功能，同時參與mRNA的轉(zhuǎn)錄并維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。許多研究表明，在FTLD-TDP或者ALS患者發(fā)現(xiàn)的TDP-43蛋白通常表現(xiàn)為高度磷酸化、泛素化、易裂解、移位到細胞質(zhì)并聚集。這些特征使TDP-43喪失了正常功能，相反具有毒性作用，誘導(dǎo)細胞凋亡以及運動神經(jīng)元軸突變短，髓鞘的脫失。目前發(fā)

3、現(xiàn)突變的TDP-43會引起線粒體功能障礙、氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)TDP-25蛋白的分子量為25kDa，是TDP-43的C末端被酶分解的片段之一。TDP-25可以促進TDP-43包涵體的形成，對運動神經(jīng)元具有更強的毒性作用。TDP-25引起線粒體功能紊亂以及加速氧化損傷，運動神經(jīng)元變性，在ALS的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。
　　TDP-43可引起細胞的高興奮性，興奮性增高的神經(jīng)元會導(dǎo)致異常動作電位的爆發(fā)，引起細胞內(nèi)鈣超載，產(chǎn)生興奮性毒性。

4、目前研究發(fā)現(xiàn)TDP-43的表達會引起細胞線粒體功能障礙，能量不足，加重氧化損傷。主要表現(xiàn)為活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)增多，細胞不能維持正常的清除作用。大量的活性氧聚集使得線粒體膜電位異常以及呼吸鏈損傷，引起能量依賴性離子通道功能改變，同時使得細胞內(nèi)高鉀和細胞外高鈉的離子濃度發(fā)生改變。目前研究還發(fā)現(xiàn)ALS患者運動神經(jīng)元鈉離子內(nèi)向電流的增加，其機制主要與持續(xù)性鈉通道的表達上調(diào)和（或）該通道功能異常

5、相關(guān)，而內(nèi)向鈉離子電流增大直接導(dǎo)致了運動神經(jīng)元較易爆發(fā)動作電位從而增加了能量的消耗和自由基的產(chǎn)生。
　　N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)是一種分子量較小的半胱氨酸的衍生物。由于其小的分子量以及分子結(jié)構(gòu)決定了易通過細胞膜，進入細胞后脫乙?；蔀楣入赘孰牡暮铣傻谋仨毎被?，又稱為還原型谷胱甘肽的前體。NAC的主要功能一方面是維持細胞內(nèi)氧化還原電勢穩(wěn)定，另一方面還可以透過細胞膜及線粒體膜通過分子內(nèi)結(jié)構(gòu)清除細胞

6、內(nèi)的ROS，成為一種有效的抗氧化劑。本實驗通過應(yīng)用不同濃度NAC作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運動神經(jīng)元細胞后記錄持續(xù)性鈉電流，進一步分析NAC對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25細胞的作用以及TDP-25在ALS發(fā)病機制中的作用。
　　目的:本實驗研究目的是分別檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25和空質(zhì)粒的運動神經(jīng)元樣細胞的持續(xù)性鈉電流，并比較電流是否存在差別;分析不同濃度N-乙酰半胱氨酸對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25運動神經(jīng)元樣細胞的作用。進一步探究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP

7、-25運動神經(jīng)元樣細胞的興奮性增高與氧化損傷在ALS發(fā)病機制中的作用。
　　方法:本實驗應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25和Empty（空質(zhì)粒）兩種細胞，該NSC34細胞系由本實驗室構(gòu)建，應(yīng)用規(guī)范的細胞培養(yǎng)方法對其進行培養(yǎng)，首先通過篩選單克隆細胞，然后免疫組化鑒定TDP-25蛋白的表達程度，選擇TDP-25蛋白表達95％以上的細胞。將這些篩選后的單克隆細胞系進行培養(yǎng)、傳代，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25細胞以及空質(zhì)粒細胞。在全細胞膜片鉗技術(shù)下，記

8、錄穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TDP-25細胞、空質(zhì)粒細胞的持續(xù)性鈉電流;將終濃度分別為20umol/LNAC、50umol/LNAC、80umol/LNAC作用于TDP-25細胞24小時后，分別記錄3組不同濃度下細胞的持續(xù)性鈉電流的水平。統(tǒng)計持續(xù)性鈉電流的差異性。
　　結(jié)果:TDP-25組與Empty組的持續(xù)性鈉電流相比，TDP-25組的電流幅度以及電流密度增大(P=0.03，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義)。給予藥物濃度分別為20umol/L，50

9、umol/L，80 umol/L的NAC作用于TDP-25組細胞24小時后的持續(xù)性鈉電流相比較，50umol/LNAC組的持續(xù)性鈉電流幅度減少明顯(P=0.04，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義);20umol/L組電流幅度減小，與TDP-25組比較變化不明顯(P＞0.05無統(tǒng)計學(xué)意義);80 umol/L濃度時發(fā)現(xiàn)無明顯變化(P＞0.05無統(tǒng)計學(xué)意義)。五組間I-V曲線進行比較分析得出持續(xù)性鈉電流均存在電壓依賴性，曲線呈現(xiàn)一個V字形，Emp

10、ty組、50μmol/L NAC組I-V曲線較TDP-25組上移。
　　統(tǒng)計結(jié)果如下:
　　TDP-25組: n=25電流幅度:-74.69±17.64pA;電流密度:-3.18±1.723 pA/pf
　　Empty組: n=20電流密度:-30.60±6.72pA;電流密度:0.52±0.024pA/pf
　　藥物作用TDP-25結(jié)果如下:
　　20μmol/L NAC組:n=10電流幅度:-62.62

11、±11.63pA;電流密度:0.52±0.024pA/pf
　　50μmol/L NAC組::n=10電流幅度:-34.56±10.07pA;電流密度:-1.73±0.42 pA/pf
　　80μmol/L NAC組:n=10電流幅度:-66.30±18.23pA;電流密度:-3.06±0.955 pA/pf
　　結(jié)論:在本實驗中，我們得出穩(wěn)定表達TDP-25的運動神經(jīng)元樣細胞與對照組比較持續(xù)性鈉電流明顯增大，提示細胞