谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸乳脂肪球上皮生長因子E8表達的影響.pdf

1、目的：乳脂肪球上皮生長因子 E8（MFG-E8）是由巨噬細胞和樹突狀細胞合成分泌的一種可以與磷脂酰絲氨酸及整合素受體結合的糖蛋白。研究指出MFG-E8在維持腸上皮穩(wěn)態(tài)、促進腸黏膜損傷修復中可發(fā)揮重要作用，這使得重組MFG-E8作為一種修復腸道損傷的潛在制劑進入人們的視野并引起廣泛的關注。然而目前對于MFG-E8的研究主要集中在腸道炎癥性損傷方面，對于其在腸道饑餓損傷方面的研究尚未有相關報道。因此我們首先借助小鼠饑餓損傷模型，檢測饑餓應激

2、后小鼠小腸黏膜MFG-E8表達的變化情況，探討MFG-E8在小腸饑餓應激中發(fā)揮的作用。其次，作為人體含量最多的一種氨基酸，谷氨酰胺（Gln）可減輕由饑餓導致的腸道損傷，但其具體機制仍不明了。我們通過小鼠饑餓狀態(tài)下谷氨酰胺灌胃模型檢測谷氨酰胺對饑餓小腸黏膜MFG-E8表達的影響，嘗試探索谷氨酰胺是否可以通過影響腸道MFG-E8的表達而發(fā)揮腸道保護作用。最后，因小腸MFG-E8由固有層巨噬細胞表達，我們在體外細胞培養(yǎng)實驗中，通過用不同濃度谷

3、氨酰胺培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW264.7），檢測其對MFG-E8蛋白表達的影響，以對體內試驗的結果進行初步的機制探討。
　　方法：第一部分：首先驗證饑餓損傷是否可以改變腸道MFG-E8的表達。通過預實驗及相關實驗報道，我們得知小鼠在禁食24h后，出現(xiàn)明顯的應激行為；48h后活動明顯減少；72h后活動已很微弱；84h后小鼠開始死亡。小鼠體重下降在禁食72h后趨于平緩，因此我們選取小鼠體重下降近于最低值而又未死亡的禁食7

4、2h的小鼠作為研究對象。將20只雄性C57BL/6小鼠隨機分為兩組。正常對照組(NC組，10只)正常飲食，自由攝水；全饑餓組(S組，10只)無飼料供給，自由攝水。饑餓72h后脫頸法處死小鼠，取小腸組織。HE染色看小腸絨毛發(fā)育情況；TUNEL法檢測細胞凋亡；實時熒光定量PCR和蛋白質免疫印跡法檢測小腸組織MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表達。第二部分：測谷氨酰胺對饑餓小鼠小腸MFG-E8表達的影響。將25只雄性C57BL/6小鼠隨機

5、分為正常對照組(NC組，n=5),全饑餓組(S組，n=5)和谷氨酰胺灌胃組(G組，共15只)。其中谷氨酰胺灌胃組根據(jù)不同的灌胃量（1g/kg/d，3g/kg/d，5g/kg/d）分為3個亞組G1組（n=5）、G3組（n=5）、G5組（n=5）。NC組正常飲食，自由飲水。S組和G組僅自由飲水。G組給予不同劑量谷氨酰胺水溶液灌胃，每天一次，每次0.5ml，共三次。NC組和S組每天給予生理鹽水灌胃0.5ml。72h后脫頸法處死小鼠取小腸組織。

6、同第一部分測小腸絨毛發(fā)育情況，細胞凋亡，小腸組織MFG-E8mRNA及MFG-E8蛋白表達。第三部分：體外測不同濃度谷氨酰胺對RAW264.7細胞的增殖及對MFG-E8表達的影響。正常嚙齒類動物和人類血清谷氨酰胺的濃度約為0.6mM，正常細胞培養(yǎng)及長期儲存的谷氨酰胺濃度為2mM，同時研究指出大于等于8mM的谷氨酰胺濃度可誘導多種細胞和組織大量表達熱休克蛋白（HSPs），抑制細胞炎癥反應。因此我們選用0、0.6、2、10mM的谷氨酰胺孵育

7、RAW264.7細胞，測谷氨酰胺對其增殖以及表達MFG-E8的影響。
　　結果：第一部分：小鼠饑餓72h后小腸絨毛呈現(xiàn)萎縮性改變：黏膜層薄而稀疏，隱窩深度降低，絨毛面積減少，同時伴隨著上皮細胞凋亡的增加。MFG-E8在基因水平和蛋白水平表達均增加。第二部分：谷氨酰胺灌胃后小腸絨毛萎縮狀態(tài)改善，黏膜上皮細胞凋亡減少，尤以3g/kg/d組最為顯著。MFG-E8mRNA和蛋白均較單純饑餓組降低，且mRNA降低與谷氨酰胺灌胃量呈劑量依賴。

8、第三部分：在體外，谷氨酰胺對 RAW264.7細胞生長增殖具有重要促進作用。隨著谷氨酰胺濃度增高細胞增殖越快。當缺乏谷氨酰胺時，細胞呈現(xiàn)不增長甚至負增長。而其表達 MFG-E8蛋白的能力卻隨著濃度增高而降低，即缺乏谷氨酰胺時，MFG-E8蛋白表達量最高。
　　結論：1、小鼠饑餓應激導致小腸出現(xiàn)損傷性改變：腸絨毛萎縮，腸上皮細胞凋亡增加。而此時出現(xiàn)MFG-E8蛋白及mRNA水平的升高，提示MFG-E8的升高可能是小腸饑餓損傷后的一種

9、自我保護性反應。2、谷氨酰胺灌胃改善了小鼠饑餓應激后出現(xiàn)的小腸絨毛萎縮、上皮細胞凋亡增加，證實谷氨酰胺對于饑餓應激導致的小腸損傷確實有保護作用。小鼠饑餓應激后出現(xiàn)MFG-E8蛋白及mRNA水平增高，而谷氨酰胺灌胃后MFG-E8蛋白及mRNA均較單純饑餓狀態(tài)下降低。進一步證明作為一種與腸黏膜損傷修復密切相關的蛋白質，MFG-E8可作為饑餓后反映小腸代償功能的指標。關注 MFG-E8表達的變化，可及時了解腸道的功能狀況以采取相應的干預措施。