卵巢癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)及分子表型分析.pdf

1、第一部分:卵巢癌免疫磁珠的合成及表征
　　目的:制備靶向卵巢癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的免疫磁珠并對(duì)免疫磁珠的活性進(jìn)行表征。
　　方法：采用EDC/NHS活化羧基磁珠，活化的羧基末端通過(guò)EDC與抗體分子上的氨基相交聯(lián)，NHS穩(wěn)定合成的免疫磁珠。EPCAM為上皮細(xì)胞胞膜表面特異分子，為共有細(xì)胞表面標(biāo)志物。MUC16為卵巢癌細(xì)胞膜表面特異分子，是卵巢癌組織特異細(xì)胞表面標(biāo)志物。羧基磁珠活化后將EPCAM/MUC16抗體偶聯(lián)在磁珠表面制備卵巢癌

2、特異的免疫磁珠。通過(guò)IF及FCM方法對(duì)合成的免疫磁珠分散性及免疫活性進(jìn)行鑒定。
　　1結(jié)果：通過(guò)用抗單克隆抗體Fc段的熒光二抗對(duì)免疫磁珠進(jìn)行流式分析，顯示EPCAM、MUC16兩種抗體與磁珠結(jié)合后表達(dá)率分別為：94.17±1.05％、97.80±0.60%，免疫熒光分析示磁珠與抗體結(jié)合后分散性良好。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)成功制備出卵巢癌特異性EPCAM/MUC16免疫磁珠，免疫磁珠分散均勻，抗體活性高，提示免疫磁珠具有較高活性結(jié)合

3、目的細(xì)胞。
　　第二部分:卵巢癌CTCs模型建立與免疫磁珠檢測(cè)
　　目的:探討EPCAM/MUC16免疫磁珠富集卵巢癌外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的靈敏度與特異性。
　　方法:培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，流式分析SKOV3細(xì)胞表面EPCAM/MUC16表達(dá)率。將20/50/100個(gè)SKOV3細(xì)胞加入4ml健康志愿者外周血中制備循環(huán)腫瘤細(xì)胞模型，分別用EPCAM免疫磁珠，MUC16免疫磁珠，EPCAM/MUC16免疫磁珠對(duì)循環(huán)腫瘤

4、細(xì)胞模型進(jìn)行富集與鑒定。
　　結(jié)果: EPCAM/MUC16在SKOV3細(xì)胞株中的表達(dá)率分別為99.41%,99.99%。EPCAM、MUC16單獨(dú)與共同的檢測(cè)限值均為每4ml血液中有50個(gè)SKOV3細(xì)胞，但能穩(wěn)定檢出細(xì)胞的界限值為每4ml血液中有100個(gè)SKOV3細(xì)胞，三組結(jié)果統(tǒng)計(jì)無(wú)差異（P﹥0.05）。免疫磁珠不與外周血白細(xì)胞相結(jié)合，僅與部分細(xì)胞膜碎片相結(jié)合。
　　結(jié)論: EPCAM/MUC16免疫磁珠對(duì)卵巢癌循環(huán)腫瘤細(xì)

5、胞具有較高的靈敏度與特異性。
　　第三部分:卵巢癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞分子表型分析
　　目的:探討卵巢癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中EPCAM，MUC16分子的表達(dá)情況
　　方法:將采集的30例Ⅲ期上皮性卵巢癌12ml外周血樣本，每例均分為4ml樣本，同時(shí)使用EPCAM免疫磁珠、MUC16免疫磁珠、混合磁珠（兩種磁珠1:1混合）進(jìn)行檢測(cè)，三種檢測(cè)方法所使用磁珠總量相同。免疫磁珠富集的細(xì)胞HE染色后鑒定檢測(cè)值。
　　結(jié)果: EPCAM、

6、MUC16單獨(dú)檢測(cè)CTCs與共同檢測(cè)CTCs的檢測(cè)值分別為22±11、14±6、28±12(P<0.05)。通過(guò)對(duì)免疫磁珠富集出的CTCs進(jìn)行HE染色顯示免疫磁珠圍繞吸附CTCs。
　　結(jié)論:通過(guò)EPCAM、MUC16免疫磁珠單獨(dú)與共同應(yīng)用檢測(cè)CTCs模型與病人血樣本，結(jié)果顯示在敏感性檢測(cè)中，其無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但在患者外周血中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，推測(cè)外周血中EPCAM、MUC16表達(dá)比率較培養(yǎng)的SKOV3穩(wěn)定細(xì)胞株發(fā)生變化。EPCAM免疫