原發(fā)性肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞的EMT分型及臨床意義.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌是世界上最常見的具有高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一，手術切除是大多數(shù)原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)的首選治療方式，然而術后復發(fā)是影響PLC預后的主要原因。目前對于PLC的復發(fā)監(jiān)測只要依靠B超、CT及血清AFP，這些傳統(tǒng)監(jiān)測手段是無法做到早期診斷復發(fā)。因此，發(fā)現(xiàn)具有早期診斷PLC復發(fā)的敏感性生物標志物至關重要。
　　在過去的幾十年中，腫瘤患者外周血中循環(huán)腫瘤細胞的檢測已經獲

2、得越來越多的關注。因為外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測是一種簡單、可重復和微創(chuàng)的操作，其可作為理想的取樣檢測手段。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是指存在于實體瘤外的腫瘤細胞。事實上，源自原發(fā)性腫瘤灶的具有高度侵襲性的腫瘤細胞不斷增殖，它們在離開原發(fā)腫瘤灶并進入外周血后成為具有侵襲和轉移潛能的循環(huán)腫瘤細胞。因此，近年來CTCs在腫瘤診斷，復發(fā)和轉移中的作用得到越來越多的研究。已有研究證實，上皮-間質轉化是一

3、種細胞形態(tài)轉化過程:細胞失去其上皮特征并獲得間充質性質。同時，間充質細胞可能轉化為上皮表型細胞，從而促使腫瘤細胞轉移定值。許多研究已經建立了上皮-間質轉化和各型CTCs形成之間的聯(lián)系。然而，目前基于CTCs的檢測技術有數(shù)十種，其每種檢測技術的方法及原理各有不同，因而選取并深入研究肝癌CTCs檢測技術對于實施本項目起著關鍵作用。在本研究中，我們首先選取并確立了CanPatrolTM肝癌CTCs檢測技術，明確其檢測技術的基本方法和原理，研究

4、其檢測技術的靈敏度、特異度及可重復性;在此檢測技術的基礎上分析了EMT表型CTCs在PLC和非惡性肝臟疾病(nonmalignant liver diseases，NLD)之間的差異，試圖提高PLC診斷的準確性。
　　眾所周知，腫瘤復發(fā)和轉移是一個非常復雜的過程，而其血型轉移過程通常需要CTCs從原發(fā)性腫瘤灶進入外周血.并且由于外周血CTCs檢測是一種簡單，可重復和微創(chuàng)過程，因此在過去幾十年中，CTCs在腫瘤診斷、復發(fā)和轉移中的功

5、能一直在積極研究。但是對于各亞型循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤復發(fā)的研究目前卻甚少，本研究通過檢測PLC患者外周血中的各亞型CTCs，分析其與PLC復發(fā)的關系，初步探討各亞型CTCs檢測在早期預測PLC復發(fā)中的臨床價值。
　　方法：
　　采集PLC患者外周血，利用多重原位RNA雜交檢測技術分離檢測外周血中的CTCs，并通過細胞上皮型標志物(EpCAM、CK8，18，19)及間質型標志物(Vimentin、Twist)對CTCs進一步分型

6、，第一組共采集73例入院診斷為肝占位患者的5-mL外周血用來檢測CTCs，其中最后入組45位原發(fā)性肝癌患者（年齡中位數(shù):55，范圍:18至77）和13位肝良性病患者（年齡中位數(shù):50，范圍:35至74）。第二組選取2014年3月至2016年3月期間行根治性切除術的原發(fā)性肝癌患者62例（男:58例，女:4例;年齡:median:55，rang:30～79）行前瞻性研究，均抽取5-mL外周血用來檢測CTCs。我們通過采用CanPatrolT

7、MCTCs富集技術來檢測外周血中的EMT表型CTCs。通過使用該技術，判斷并計數(shù)不同表型腫瘤細胞，研究其在PLC中診斷及術后預測復發(fā)的臨床價值。
　　統(tǒng)計學處理:所有統(tǒng)計計算用SPSS v21.0進行，P值＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　應用CanPatrolTM系統(tǒng)將檢測到的外周血中的EMT表型CTCs分成以下三類:上皮型CTCs（上皮標記染色），間質型CTCs（間質標記染色），混合型CTCs（上皮

8、和間質標記染色）同時，為了檢測該技術分離鑒定CTCs的回收效率及敏感性，我們將0，10，50，100，200個培養(yǎng)的腫瘤細胞加入健康人的5mL外周血樣本中，與實際加入的腫瘤細胞數(shù)目進行對比分析，結果顯示外周血中分別加入0，10，50，100，200個HepG2細胞的平均檢出數(shù)為0，8±1.41，43.33±2.49，85±3.56，182.33±4.99，線性回歸模型分析得到檢出的CTCs與加入的腫瘤細胞數(shù)量具有明顯線性相關性(r2=0

9、.999)。通過應用該技術對PLC及NLD的診斷性研究，首先入組73例診斷為肝占位的患者中;3例患者未行進一步診斷，10名患者最終被診斷為其他惡性腫瘤肝轉移，45名被診斷為原發(fā)性肝癌，13名被診斷為肝良性病;最終，我們發(fā)現(xiàn)除了上皮型CTCs，其它各類型EMT表型CTCs計數(shù)在PLC中顯著高于NLD，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在深入研究EMT表型的CTCs在PLC與復發(fā)的關系中，我們入組了62例經根治性手術治療的PLC患者，通過

10、隨訪，26例最終診斷為復發(fā)，36例診斷為未復發(fā)。復發(fā)組與未復發(fā)組CTCs總數(shù)（中位數(shù):6vs2.5），上皮型CTCs（中位數(shù):0.5vs0），混合型CTCs（中位數(shù):3vs1），間質型CTCs（中位數(shù):1vs0）。最終發(fā)現(xiàn);復發(fā)組CTCs總數(shù)、間質型CTCs、混合型CTCs計數(shù)顯著高于未復發(fā)患者。為了確定與復發(fā)相關的各型CTCs的截點值，行ROC曲線分析定義各型CTCs的截點值:CTCs總數(shù)≥4為陽性，間質型CTCs≥1為陽性，混合型C

11、TCs≥3為陽性.經多因素cox回歸發(fā)現(xiàn)，門脈癌栓(HR=2.905,P=0.023)及間質型CTCs（HR=3.453，P=0.007）陽性為復發(fā)的獨立危險因素。K-M檢驗進一步研究間質型CTCs與復發(fā)時間的關系，結果發(fā)現(xiàn)間質型CTCs陽性患者術后無瘤生存時間顯著縮短(P＜0.001)。
　　結論：
　　1、研究證明了EMT現(xiàn)象存在于原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs中;2、外周血中間質型CTCs和混合型CTCs計數(shù)將有望成為診