基于MAO活性的PD篩選模型建立及構(gòu)效研究.pdf

1、單胺氧化酶（Monoamine oxidase, MAO）是一種存在于細(xì)胞線粒體外膜的黃素蛋白酶，可分為 MAO-A和 MAO-B兩種亞型。其生理作用主要是催化內(nèi)源性和外源性單胺遞質(zhì)的脫氫氧化，與去甲腎上腺素（Norepinephrine, NE）、5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine,5-HT）和多巴胺（Dopamine,DA）的含量緊密相關(guān)。當(dāng)MAO活性異常升高時(shí)可使單胺類遞質(zhì)紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)類疾病，如抑郁癥（Dep

2、ression, DEP）、帕金森病（Parkinson's disease, PD）和阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease, AD）等。在臨床上，已用MAO抑制劑（Monoamine oxidase inhibitor, MAOI）抑制異常升高的 MAO活性，其中 MAO-A抑制劑（Monoamine oxidase-A inhibitor, MAO-AI）主要用于治療抑郁癥；MAO-B抑制劑（Monoamine ox

3、idase-B inhibitor, MAO-BI）主要用于治療PD和AD。在MAO-B抑制劑中，雷沙吉蘭可選擇性抑制MAO-B，減少 DA代謝，延長(zhǎng) DA的作用時(shí)間，改善帕金森行為能力，并具有神經(jīng)元保護(hù)作用和延緩病程的發(fā)展，但是雷沙吉蘭仍然伴有體位性低血壓、頭痛、心動(dòng)過(guò)速以及嘔吐等嚴(yán)重的不良反應(yīng)。為此，設(shè)計(jì)篩選高效低毒的MAO-B抑制劑，對(duì)于緩解PD病情，改善PD患者身體健康及生活質(zhì)量仍然是目前的研究熱點(diǎn)之一。本課題擬建立一種快速、靈

4、敏的MAO活性測(cè)定方法，用于MAO抑制劑的高通量篩選，并初步研究新設(shè)計(jì)合成的 MAO抑制劑（PPA14-R、PPA14-S和 PPA14）對(duì)MAO活性的作用以及在PD模型小鼠作用中的構(gòu)效關(guān)系，其主要工作和結(jié)果如下：
　　1.成功建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏和環(huán)保的DNPH分光光度法。該方法以芐胺和5-HT分別作為MAO-B和MAO-A的底物，以2，4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine, DNPH）為衍

5、生試劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定其最佳條件為：在磷酸鉀緩沖液（25 mmol/L, pH7.60）條件下，于37 ℃，酶預(yù)孵育20 min，按芐胺（0.016 mol/L）或5-HT（0.02 mol/L）與MAO混懸液（4.69μg/μL）體積比（1:1）加200μL，催化反應(yīng)60 min后加400μL DNPH，衍生化反應(yīng)40 min后2 mLNaOH，5 min后分別于465 nm和425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定MAO-B和MAO-A的活性。
　

6、　2.采用DNPH分光光度方法，測(cè)得雷沙吉蘭對(duì)SD大鼠腦MAO-B和MAO-A活性抑制作用的IC50值分別為8.00×10-9 mol/L和2.59×10-7 mol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道[1]IC50值（MAO-B:4.43±0.92×10-9 mol/L;MAO-A:4.12±1.23×10-7 mol/L）具有相同數(shù)量級(jí)，這表明該方法具有較好的可靠性。
　　3.在體外實(shí)驗(yàn)中，以雷沙吉蘭作對(duì)照，新設(shè)計(jì)合成的 MAO抑制劑（PPA14

7、-R、PPA14-S和PPA14）對(duì)MAO-B具有很好的抑制作用和選擇性，其中PPA14-R對(duì)MAO-B的抑制作用最強(qiáng)，這些化合物與雷沙吉蘭的作用相似。
　　4.在以MPTP誘導(dǎo)PD亞急性模型小鼠中，以雷沙吉蘭作對(duì)照，新設(shè)計(jì)合成的MAO抑制劑（PPA14-R、PPA14-S和PPA14）連續(xù)治療14天，結(jié)果表明PPA14-R、PPA14-S和PPA14與雷沙吉蘭的作用相似，均選擇性抑制肝MAO-B，可緩解PD小鼠的行為障礙并具有一

8、定的神經(jīng)元保護(hù)作用，其中PPA14-R對(duì)腦MAO-B和MAO-A的抑制作用、行為改善能力和神經(jīng)元保護(hù)作用較其他化合物強(qiáng)，且略強(qiáng)于雷沙吉蘭。
　　綜上所述，構(gòu)建的DNPH分光光度法，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏和環(huán)保的特點(diǎn)，并能較好用于體內(nèi)外MAO活性的研究，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新設(shè)計(jì)合成的MAO抑制劑（PPA14-R、PPA14-S和PPA14）與雷沙吉蘭相似，均對(duì)MAO-B具有較好的選擇性，可改善PD模型小鼠的行為障礙，且具有一定的神經(jīng)元保護(hù)