α5-nAChR-STAT3反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在尼古丁促非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中的作用及機(jī)制.pdf

1、[背景]
　　肺癌是一種常見的肺部惡性疾病，其發(fā)病率和死亡率均居癌癥之首，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌類型85％以上。吸煙是誘發(fā)肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)境因素之一。煙草中最重要的成癮成分尼古丁可通過結(jié)合并激活尼古丁乙酰膽堿受體(Nicotinic AcetylcholineReceptors，nAChR)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。近年來，全基因組關(guān)聯(lián)研究(GW

2、AS)表明，位于15號染色體長臂，編碼尼古丁乙酰膽堿受體CHRNA5/A3/B4基因簇的變異與吸煙相關(guān)性肺癌密切相關(guān)。其中，編碼α5-尼古丁乙酰膽堿受體(α5-nAChR)的基因CHRNA5與肺癌的發(fā)生發(fā)展尤為相關(guān)，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中作用及機(jī)制尚不明確。
　　尼古丁結(jié)合肺癌細(xì)胞膜表面nAChRs，引起nAChRs通道構(gòu)象發(fā)生變化，并激活下游多重信號通路。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，α5-nAChR可激活下游PI3K/AKT、MAPK等信號

3、通路影響尼古丁誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲，初步驗(yàn)證其在肺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步闡明α5-nAChR在肺癌發(fā)生中的作用和機(jī)制，我們通過對CHRNA5啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子區(qū)域具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子STAT3的結(jié)合位點(diǎn)，但是α5-nAChR與STAT3之間相互作用關(guān)系以及對肺癌細(xì)胞功能的影響未見報(bào)道。
　　本課題擬研究α5-nAChR、STAT3在非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)及與相關(guān)臨床病理參數(shù)的

4、關(guān)系，同時(shí)分析α5-nAChR/STAT3反饋調(diào)節(jié)環(huán)路在尼古丁誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖過程中的作用及機(jī)制，將有助于進(jìn)一步明確α5-nAChR在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用，對于進(jìn)一步研究NSCLC的防治具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用前景。
　　[目的]
　　1.檢測NSCLC組織中α5-nAChR與pSTAT3的表達(dá)，并分析與吸煙史、生存期等相關(guān)臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;
　　2.體外研究NSCLC細(xì)胞中α5-nAC

5、hR與STAT3相互調(diào)節(jié)作用的機(jī)制及在尼古丁促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖中的作用。
　　[方法]
　　1.通過免疫組化方法檢測NSCLC組織病理標(biāo)本中α5-nAChR和STAT3表達(dá);并分析α5-nAChR的表達(dá)與患者吸煙史之間關(guān)系。
　　2.通過在線數(shù)據(jù)庫分析α5-nAChR的表達(dá)對吸煙相關(guān)性肺腺癌患者生存和生存期的影響，同時(shí)通過患者病例資料，使用Kaplan-Meier方法分析并繪制生存曲線，分析α5-nAChR與pST

6、AT3表達(dá)雙陽性對肺腺癌患者生存期的影響。
　　3.NSCLC細(xì)胞系在尼古丁作用下，通過Western blot方法檢測α5-nAChR、pSTAT3和tSTAT3的表達(dá)變化。
　　4.設(shè)計(jì)合成針對CHRNA5基因的小干擾RNA片段，經(jīng)lipo2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549和H1299 NSCLC細(xì)胞，Western blot和RT-PCR方法分別檢測尼古丁處理組、siRNA-CHRNA5組和（尼古丁+siRNA-CHRNA5組）

7、中α5-nAChR和下游JAK2/STAT3的表達(dá)變化。
　　5.ChIP實(shí)驗(yàn)檢測NSCLC細(xì)胞中STAT3與CHRNA5啟動(dòng)子區(qū)域有無結(jié)合位點(diǎn)。
　　6.設(shè)計(jì)合成針對STAT3基因小干擾RNA片段，經(jīng)lipo2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，Western blot和RT-PCR方法分別檢測尼古丁處理組、siRNA-STAT3組和（尼古丁+siRNA-STAT3組）中STAT3、JAK2及α5-nAChR的表達(dá)變化。
　

8、　7.CCK-8方法檢測干擾α5-nAChR和/或STAT3后對尼古丁促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在130例NSCLC組織病理標(biāo)本中，α5-nAChR和STAT3的陽性表達(dá)率分別為60％和66.9％，在87例STAT3高表達(dá)的肺癌組織中，其中有58例α5-nAChR表達(dá)水平提高，差異顯著(P＜0.05)。此外在55例NSCLC患者組織病理標(biāo)本中，25例患者有吸煙史，其中19例α

9、5-nAChR表達(dá)陽性，表明α5-nAChR表達(dá)和吸煙史密切相關(guān)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。
　　2.數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，在具有吸煙史的肺腺癌患者中，α5-nAChR表達(dá)陽性的患者生存期明顯低于α5-nAChR表達(dá)陰性的患者(P＜0.05)。同時(shí)Kaplan-Meier法計(jì)算生存率并繪制生存曲線分析，α5-nAChR(+)/STAT3(+)的患者生存期明顯比α5-nAChR（-）/STAT3(+)(P=0.034)和α5-nAC

10、hR(+)/STAT3（-）(P=0.026)的患者低。
　　3.Western blot檢測結(jié)果顯示，相對于對照組，1μM尼古丁刺激A549、H1299和H1975 NSCLC細(xì)胞系16h后，α5-nAChR和pSTAT3在蛋白水平表達(dá)均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但tSTAT3蛋白水平不發(fā)生變化。
　　4.siRNA-CHRNA5轉(zhuǎn)染A549、H1299 NSCLC細(xì)胞后，與陰性對照組相比，siRNA-CH

11、RNA5組α5-nAChR、JAK2和STAT3表達(dá)水平下降(P＜0.05)，與1μM尼古丁組相比，（1uM尼古丁+siRNA-CHRNA5）組，α5-nAChR、JAK2和STAT3表達(dá)水平下降(P＜0.05)。
　　5.ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CHRNA5啟動(dòng)子區(qū)域具有pSTAT3蛋白轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，1μM尼古丁刺激A549細(xì)胞后，pSTAT3與CHRNA5啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合明顯增加(P＜0.05)，當(dāng)siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)

12、胞后，pSTAT3與CHRNA5啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，與陰性對照組相比，siRNA-STAT3組α5-nAChR、JAK2和STAT3表達(dá)水平下降(P＜0.05)，與1uM尼古丁組相比，(1uM尼古丁+siRNA)轉(zhuǎn)染組，5-nAChR、JAK2和STAT3表達(dá)水平下降(P＜0.05)。
　　7.通過A549、H1299細(xì)胞CCK-8實(shí)驗(yàn)

13、，對比陰性對照組，發(fā)現(xiàn)siRNA-CHRNA5和/或siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染組NSCLC細(xì)胞增殖抑制較陰性對照組升高(P＜0.05)。在1μ M尼古丁組，與尼古丁+siRNA-CHRNA5/siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖明顯受抑制(P＜0.05)。
　　[結(jié)論]
　　1.在NSCLC組織中，α5-nAChR表達(dá)明顯高于癌旁組織，且和患者吸煙史1密切相關(guān)，α5-nAChR高表達(dá)伴隨著患者較低的生存率，提示α