α5-nAchR對尼古丁促人肺腺癌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 肺癌是一種常見的肺部惡性腫瘤，其死亡率已占癌癥死亡率之首。吸煙已被公認(rèn)為引起肺癌的最重要的致癌因素之一。煙堿型乙酰膽堿受體(Nicotinic Acetylcholine Receptors， nAchRs)信號途徑是近年來肺癌靶向研究的熱點(diǎn)。
　　 全基因組關(guān)聯(lián)分析表明，編碼α5-煙堿型乙酰膽堿受體（α5-nAchR）的CHRNA5基因與肺癌發(fā)生尤為相關(guān)，但α5-nAchR在肺癌發(fā)生中作用及機(jī)制的研究尚在

2、起步階段。本研究以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549，H1299，H1975為研究對象，通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定尼古丁促細(xì)胞增殖的最適作用時間和濃度，觀察不同細(xì)胞株對尼古丁的敏感性；構(gòu)建細(xì)胞饑餓模型，在尼古丁作用下，通過Westernblot研究α5-nAchR及細(xì)胞增殖信號通路下游信號分子p-Src418，p-Raf340，341-1，p-Rb807的表達(dá)變化。設(shè)計CHRNA5-siRNA片段并經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞，通

3、過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，熒光定量PCR以及Westernblot等實(shí)驗(yàn)方法，研究探討siRNA干擾CHRNA5基因表達(dá)對人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響以及對下游信號通路的影響及機(jī)制。
　　 本研究旨在闡明α5-nAchR對尼古丁促人肺腺癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制，為揭示肺癌的分子病理機(jī)制提供的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對尋找腫瘤有效預(yù)防、治療新靶點(diǎn)工作有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 方法：
　　 1．通過基因測序法篩選三株α5-nAch

4、RSNP398不同基因型的肺腺癌細(xì)胞株，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測比較在不同濃度和不同時間下尼古丁對三株細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。
　　 2．構(gòu)建細(xì)胞饑餓模型，在尼古丁作用下，通過Western blot等方法檢測α5-nAchR及細(xì)胞增殖Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)分子p-Src418，p-Raf340，341-1，p-Rb07的表達(dá)變化。
　　 3．設(shè)計合成CHRNA5-siRNA片段，并經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肺癌A

5、549細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，熒光定量PCR、Western blot方法檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后α5-nAchRmRNA和蛋白表達(dá)。
　　 4．采用四甲基偶氮唑藍(lán)顯色法(MTT)觀察siRNA干擾CHRNA5表達(dá)對尼古丁促人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響。
　　 5．尼古丁處理組和(RNAi干擾+尼古丁處理)組，比較分析細(xì)細(xì)胞增殖Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)分p-Src418，p-Raf340.341-1，p-Rb807

6、的表達(dá)變化，探討α5-nAchR在尼古丁促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1．A549、H1299和H1975細(xì)胞株的SNP398基因型分別為野生型(A/A)，基因突變純合型(A/G)和雜合型(G/G)。尼古丁促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖，且存在與劑量和時間的相關(guān)性。A549和H1299細(xì)胞在1μM/L尼古丁處理24h后，細(xì)胞增殖最為顯著（PA549＜0.01，PH1299＜0.05）。而H1975細(xì)胞在10

7、pM/L尼古丁處理24h時后，細(xì)胞增殖最顯著(PH1975＜0.01)。
　　 2.0.5％新生牛血清作用48小時，使細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)，在尼古丁的作用下，與陰性對照組相比，p-Src418、p-Raf340，341-1、p-Rb807分別在15分鐘、2小時和6小時被激活(P＜0.05)。
　　 3．CHRNA5-siRNA可顯著抑制A549細(xì)胞中CHRNA5 mRNA和蛋白水平的表達(dá)(P＜0.05)。
　　 4．

8、RNA干擾下調(diào)CHRNA5表達(dá)后，肺癌細(xì)胞生長速度趨于降低。在尼古丁的作用下，與對照組相比，RNAi轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的增殖明顯受抑制(P＜0.01)。(RNAi干擾+尼古丁處理)組與尼古丁處理組相比，影響細(xì)胞增殖相關(guān)分子p-Src418，p-Raf340，341-1，p-Rb807的表達(dá)。其中，p-Src418，p-Raf340，341-1激活受到抑制，p-Rb807去磷酸化作用減弱(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　

9、 1．α5-nAchRSNP398變異體肺腺癌細(xì)胞株對尼古丁的敏感性不同，表明α5-nAchRSNP398基因多態(tài)性可能參與肺腺癌細(xì)胞對尼古丁的應(yīng)答。
　　 2．siRNA干擾沉默CHRNA5在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)可以抑制尼古丁促肺癌細(xì)胞的增殖，提示CHRNA5可能是肺癌治療的潛在靶點(diǎn)之一。
　　 3．α5-nAchR參與Raf/MAPK激酶/ERK信號通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞增殖，為肺癌病因?qū)W和靶向治療研究提供新的實(shí)驗(yàn)