脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的研究及其在與疾病相關(guān)潛在生物標志物和中藥作用機制研究中的應(yīng)用.pdf

1、脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)的一個重要分支越來越得到人們的關(guān)注。隨著分析技術(shù)的進步，針對脂質(zhì)化合物的分析技術(shù)不斷完善和提高，脂質(zhì)類化合物能夠更好、更全面的被表征、鑒定及定量分析?；谥|(zhì)組學(xué)分析技術(shù)揭示脂質(zhì)代謝異常與疾病的相關(guān)性，尋找潛在生物標志物是目前研究的熱點。本論文針對脂質(zhì)組學(xué)開展其分析技術(shù)的研究，并將所建立的分析技術(shù)應(yīng)用于與疾病相關(guān)潛在生物標志物及中藥作用機制和作用物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。
　　本論文研究建立了靶向皮膚角質(zhì)層鞘脂組學(xué)分析方

2、法，采用正相高效液相色譜聯(lián)用三重四極桿質(zhì)譜分析技術(shù)，基于皮膚角質(zhì)層中鞘脂類化合物的結(jié)構(gòu)相關(guān)色譜和質(zhì)譜特點，靶向表征皮膚角質(zhì)層中的鞘脂類化合物并同時進行含量測定。所建立的前處理方法簡單易行:將皮膚角質(zhì)層樣本收集于含內(nèi)標的甲醇溶液中，渦旋、超聲提取并氮氣吹干，復(fù)溶后即可進樣分析。色譜分離采用正相高效液相色譜法，可對皮膚角質(zhì)層中的鞘脂類化合物按照亞類進行分離，能夠?qū)崿F(xiàn)未知鞘脂化合物的推測及鑒定。質(zhì)譜采用APCI源，動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（dynami

3、c multiple reaction monitoring，dMRM）模式。APCI源在正相溶劑條件下對鞘脂類化合物有很好的響應(yīng)，能夠保證檢測靈敏度。DMRM模式能夠滿足短時間內(nèi)同時測定大量化合物的要求。所建立的方法可在單次運行時間20 min內(nèi)測定分析483個鞘脂類化合物。這些化合物涵蓋了角質(zhì)層神經(jīng)酰胺的所有12個亞類，且包含了之前未見文獻報道的糖基化神經(jīng)酰胺?？色@取標準品的各個亞類均有代表性的標準品，被測化合物可根據(jù)結(jié)構(gòu)類似的標準

4、品進行含量測定。對所建立方法進行了方法驗證:線性范圍為50-2000pmol/mL，r值均大于0.99;定量限(LOQ)為5-20 pmol/mL，檢測限(LOD)為2-10 pmol/mL;各標準化合物的回收率在83-117％之間;儀器精密度RSD均小于13.1％，且準確度在81-112％之間;穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明QC樣本在冰箱4℃放置3天穩(wěn)定;3個濃度的基質(zhì)效應(yīng)均在97-119％之間。將所建立的方法應(yīng)用于健康兒童及患兒童特應(yīng)性皮炎(AD)

5、兒童的皮膚角質(zhì)層樣本，發(fā)現(xiàn)了表征疾病與健康狀態(tài)差異的潛在生物標志物48個，涵蓋Cer[ADS]（2個）、Cer[AH]（1個）、Cer[AS]（15個）、Cer[NH]（4個）、Cer[NS]（18個）、Cer[NDS]（4個）和Cer[NP]（4個）7個亞類。將所建立的方法應(yīng)用于不同年齡組的人類角質(zhì)層樣本，發(fā)現(xiàn)了能夠表征成人與兒童年齡差異的潛在生物標志物193個，涵蓋了13個類別（12個神經(jīng)酰胺亞類及糖基化神經(jīng)酰胺），其中Cer[AD

6、S]類12個，Cer[AH]類47個，Cer[AP]類13個，Cer[AS]類33個，Cer[EODS]類4個，Cer[EOH]類12個，Cer[EOP]類4個，Cer[EOS]類19個，Cer[NDS]類17個，Cer[NH]類6個，Cer[NP]類20個，Cer[NS]類1個，糖基化神經(jīng)酰胺5個。本研究首次對兒童皮膚角質(zhì)層樣本進行了測定，為評價皮膚疾病與健康狀態(tài)屏障功能的差異提供了新的科學(xué)數(shù)據(jù)。此外，本研究還揭示了皮膚角質(zhì)層鞘脂類化

7、合物在不同年齡中的分布特點。
　　本論文優(yōu)化了實驗室已有的靶向鞘脂組學(xué)分析方法，使鞘脂類化合物的分析通量由47個增加至86個;并與實驗室已有的其他脂質(zhì)化合物（甘油酯、甘油磷脂和高豐度鞘脂）分析方法相結(jié)合，構(gòu)建了脂質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)平臺。優(yōu)化后的靶向鞘脂組學(xué)分析方法采用高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析。色譜柱為Peeke C8 SR柱(150×3.0 mm，3μm)，流動相為0.1％甲酸水（含1 mmol/L甲酸銨）-甲醇（含0.1％

8、甲酸，1 mmol/L甲酸銨）以0.5 mL/min的流速梯度洗脫。質(zhì)譜檢測模式為MRM模式，并采用分段(segments)的方式增加被測化合物數(shù)目，提高檢測靈敏度?；跇?gòu)建的脂質(zhì)組學(xué)分析平臺，研究中藥復(fù)方小續(xù)命湯(XXMD)治療慢性腦缺血(CCI)的作用，從脂代謝網(wǎng)絡(luò)的角度揭示XMD對CCI的作用物質(zhì)基礎(chǔ)和治療作用機制。研究使用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎法(2VO)建立慢性腦缺血大鼠模型，將大鼠分為假手術(shù)、模型以及模型給藥三組，模型給藥組

9、持續(xù)灌胃給予XXMD0.15 g/kg一個月后，進行藥效學(xué)評價:Morris水迷宮法檢測大鼠的學(xué)習記憶能力;超氧化物歧化酶活度(SOD)、丙二醛含量(MDA)等生化指標的測定表征氧化損傷;Nissls染色觀察海馬CA1區(qū)及大腦皮層神經(jīng)元結(jié)構(gòu);KB染色觀察腦白質(zhì)變化。實驗結(jié)果表明造模成功且給藥有效。采用靶向脂質(zhì)組學(xué)分析平臺表征了靶器官腦和血漿中脂質(zhì)化合物的輪廓變化，發(fā)現(xiàn)造模后顯著變化的脂質(zhì)類化合物以及給藥XXMD對脂質(zhì)代謝的顯著調(diào)節(jié)作用。

10、造模后腦組織中9類89個、血漿中8類53個脂質(zhì)發(fā)生顯著變化;給藥XXMD后腦組織中11類116個、血漿中12類113個脂質(zhì)代謝顯著改善。采用正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)進行多元統(tǒng)計分析，在血漿及腦組織中均發(fā)現(xiàn)了表征CCI模型損傷，以及XXMD通過影響脂代謝改善腦損傷的潛在生物標志物。在腦組織中表征造模損傷的生物標志物有8類52個，血漿中有7類38個;腦組織中表征XXMD治療作用的脂質(zhì)有10類100個，血漿中有10類73個。本

11、研究還采用色譜高分辨分析技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜樹狀圖過濾技術(shù)(MTSF)進行XXMD給藥后模型給藥組大鼠血漿及腦組織中的代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)和鑒定。在血漿中鑒定了28種原型及代謝產(chǎn)物，其中6種為原藥液成分，22種為代謝產(chǎn)物;腦組織中鑒定了2種原型及代謝產(chǎn)物，1種為原藥液成分，1種為代謝產(chǎn)物。采用Person相關(guān)性分析計算代謝物峰面積數(shù)據(jù)與潛在脂質(zhì)生物標志物含量數(shù)據(jù)之間隨時間點變化的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)的化合物對。腦組織中鑒定得到的2種代謝產(chǎn)物均能找到對應(yīng)

12、相關(guān)的脂質(zhì)化合物，共9對;血漿中所鑒定出的28種代謝產(chǎn)物有17種具有對應(yīng)相關(guān)的脂質(zhì)化合物，共95對。該分析從脂代謝網(wǎng)絡(luò)的角度揭示XXMD對CCI的作用物質(zhì)基礎(chǔ)和治療作用機制。本研究創(chuàng)新性地基于脂質(zhì)組學(xué)研究XXMD治療腦缺血的作用機理和作用物質(zhì)基礎(chǔ)，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效評價和作用機制的深入詮釋提供了有價值的研究思路和技術(shù)手段。
　　天山雪蓮（Saussurea involucrata(Kar.et Kir.) Sch.-Bip)

13、是新疆的名貴中藥材，文獻報道其含有鞘脂類化合物，具有抗癌和護膚作用。本論文基于已建立的脂質(zhì)分析平臺，建立了天山雪蓮鞘脂化合物的HPLC-LTQ/FTICRMSn定性分析方法，用于靶向鑒定天山雪蓮中特有的的鞘脂類化合物。前處理采用75％乙醇對藥材粉末進行提取。為了獲得低豐度鞘脂類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用硅膠柱色譜進行分離富集，以不同比例的氯仿-甲醇洗脫并收集各洗脫流份，蒸干、復(fù)溶后進樣分析。色譜柱為Spectra C8 SR柱(150×3.

14、0 mm，3μm)，流動相為乙腈-異丙醇（5∶2，體積比）和0.1％乙酸水（含2 mmol/L乙酸銨）以0.2 mL/min流速梯度洗脫。質(zhì)譜采用FTICRMS采集數(shù)據(jù)。一級質(zhì)譜采用全掃描模式獲得高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分辨率為50000。多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)依賴型掃描模式獲得，對豐度最強的兩個離子采集MS2質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對MS2離子中豐度最強的一個離子采集MS3質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過對鞘脂類化合物標準品裂解規(guī)律的總結(jié)推測未知鞘脂類化合物的裂解規(guī)律并對其

15、進行鑒定。本研究還建立了HPLC-LTQ/FTICRMSn分析方法鑒定天山雪蓮中的多種其他化學(xué)成分（黃酮類及苯丙素類）。前處理采用75％乙醇對藥材粉末進行提取。為了獲得低豐度鞘脂類化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用ODS柱色譜進行分離富集，以不同比例的甲醇-水洗脫并收集各洗脫流份，蒸干、復(fù)溶后進樣分析。色譜柱為Thermo Accucore C18色譜柱(4.6×100 mm，2.6μm)，流動相為乙腈、0.2％乙酸水溶液（含10 mmol/L乙酸

16、銨）以流速1.0 mL/min梯度洗脫。質(zhì)譜采用FTICRMS采集數(shù)據(jù)。一級質(zhì)譜采用全掃描模式獲得高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，分辨率為50000。多級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)依賴型掃描模式獲得，對豐度最強的兩個離子采集MS2質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并對MS2離子中豐度最強的一個離子采集MS3質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)后處理結(jié)合質(zhì)譜樹狀圖過濾技術(shù)(MTSF)進行。通過前處理技術(shù)與數(shù)據(jù)后處理技術(shù)的結(jié)合，共鑒定出了天山雪蓮中的38個化合物，含黃酮類化合物19個，苯丙素類化合物11個，鞘脂