新型熒光探針檢測(cè)體系的構(gòu)建及其在生物標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、MicroRNA(miRNA)和免疫球蛋白G(IgG)在疾病診斷中是非常重要的生物標(biāo)志物，它們種類繁多，不同種類的miRNA和IgG表達(dá)水平的高低與各自對(duì)應(yīng)的疾病發(fā)生及發(fā)展有著密切關(guān)系，因此探究其檢測(cè)方法具有重要的臨床價(jià)值。目前miRNA主要的檢測(cè)方法是Northern blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，IgG的檢測(cè)方法主要是放射性免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)。這些方法雖然具有較高的靈敏度，但是存在放射性

2、污染、耗時(shí)較長(zhǎng)、成本較高、樣本量大和假陽(yáng)性高等缺點(diǎn)。安全無(wú)害、高靈敏度、低假陽(yáng)性、低成本以及快速的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的重要需求。
　　熒光標(biāo)記是一種非放射性標(biāo)記技術(shù)，具有安全無(wú)害、背景較低、靈敏度高和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以用來(lái)滿足上述需求?；诟鞣N熒光染料構(gòu)建的熒光探針廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的檢測(cè)中。分子雜交技術(shù)由于操作簡(jiǎn)便且特異性好等優(yōu)點(diǎn)在miRNA檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。采用三明治結(jié)構(gòu)和剛性結(jié)構(gòu)的鎖核酸(lo

3、cked nucleic acid，LNA)修飾的熒光探針，可以提高miRNA與探針雜交復(fù)合物的穩(wěn)定性、降低檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性、提高檢測(cè)的靈敏度以及減少分子雜交所用的時(shí)間。稀土元素由于熒光壽命長(zhǎng)、化學(xué)位移大等特殊優(yōu)點(diǎn)可以用來(lái)降低本底熒光的干擾，且稀土元素配體的可修飾性強(qiáng)，可基于此構(gòu)建超支化的新型配體并用于IgG檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大?；谏鲜隼碚?，我們開(kāi)展了以下幾方面的工作:
　　(1)為了構(gòu)建一個(gè)安全無(wú)害、快速可視化的miRN

4、A熒光檢測(cè)體系，首先在玻片表面修飾硅烷化試劑二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化銨(DMOAP)，來(lái)實(shí)現(xiàn)捕獲探針的固定。靶基因hsa-miR-223的兩端分別和捕獲探針以及TYE563熒光染料修飾的鎖核酸熒光探針(TYE563-LNA)進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，形成三明治結(jié)構(gòu)，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)miRNA進(jìn)行定量檢測(cè)，在緩沖液中其檢測(cè)限(LOD)低至85.2fM。且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在2.5h完成，節(jié)約了大量的時(shí)間。我們用這種方法檢測(cè)

5、對(duì)比冠心病患者和健康人血清中的hsa-miR-223，40μL血清即可滿足檢測(cè)需要，節(jié)約了大量的樣本，并用qRT-PCR方法進(jìn)行了驗(yàn)證。
　　(2)為了構(gòu)建高靈敏度、低背景、低成本的IgG熒光檢測(cè)體系，分別利用分子量為600和1800的超支化聚乙烯亞胺(PEI)為分子骨架與螯合劑二乙基三胺五乙酸(DTPA)發(fā)生反應(yīng)，形成可螯合多個(gè)Eu3+的新型配體PEI-DTPA。將這種配體與抗體(anti-IgG)結(jié)合，最后通過(guò)DTPA螯合多個(gè)

6、稀土離子Eu3+，形成anti-IgG-PEI-DTPA-Eu3+復(fù)合物，通過(guò)ELISA的方法驗(yàn)證了放大熒光信號(hào)的效果。結(jié)果顯示anti-IgG-PEI600-DTPA-Eu3+熒光信號(hào)是anti-IgG-DTTA-Eu3+檢測(cè)結(jié)果的12倍，anti-IgG-PEI1800-DTPA-Eu3+的熒光檢測(cè)結(jié)果是anti-IgG-PEI600-DTPA-Eu3+的2.4倍，但是其背景熒光也隨之增強(qiáng)。采用20mg/mL的BSA對(duì)anti-Ig