新型熒光探針檢測平臺的構建及其在miRNA-21和UDG檢測中的應用.pdf

1、近年來，熒光分子探針技術基于靈敏度高、特異性強、操作簡便等特點，已經廣泛應用于化學、醫(yī)學和生物學等領域。本論文通過設計和合成多種靶向性新型分子信標，在對其性能進行研究的基礎上，將其應用到復雜生物樣品中的靶分子定量檢測、分析，結合經典分子生物學研究手段進一步探討分子信標在臨床生物大分子檢測和診斷中的潛在應用價值。
　　本文的主要研究內容如下：
　　1.分子信標用于腫瘤相關的miRNA-21表達水平的快速、簡單檢測
　　本

2、章以根據 miRNA-21序列組成設計合成可特異性識別 miRNA-21的分子信標為工具，發(fā)展了一種基于分子信標直接在總RNA中檢測miRNA-21的方法。在利用熒光波長掃描技術考察了分子信標的熱穩(wěn)定性、雜交性能和特異性以及信標與靶分子雜交條件優(yōu)化的基礎上，將該技術直接用于培養(yǎng)的腫瘤細胞和人胃癌組織中的miRNA-21表達水平檢測。結果發(fā)現：具有良好的雜交性能和特異性的分子信標檢測標準樣品的下限可達到0.5 nM，能夠快速實現腫瘤細胞和

3、組織中的miRNA表達水平差異性檢測，結果表明：在17例標本胃癌組織中有10例(59％) miRNA-21表達水平高于癌旁組織；檢測結果的可靠性進一步通過qRT-PCR進行驗證；此外，采用Western blotting對miRNA-21直接調控的目的基因PDCD4和PTEN表達水平進行檢測，發(fā)現其蛋白表達與miRNA-21表達趨勢呈負相關。
　　2.基于分子信標結合酶促信號放大用于miRNA-21的超靈敏檢測
　　本章目的

4、是利用設計和合成莖部為RNA的新型嵌合分子信標建立一種基于雙重信號放大系統(tǒng)超靈敏檢測miRNA的新方法。在通過熒光法考察該分子信標的穩(wěn)定性、抗酶切能力以及雜交條件的基礎上，以體外合成的標準 miRNA-21為檢測對象，發(fā)現這種具有雙重信號放大功能的分子信標檢測技術檢測下限可以達到1 pM，其靈敏度比純粹的分子信標檢測法高3個數量級。進一步用于胃癌組織樣品檢測結果表明：該方法可用于準確檢測0.2μg總RNA中的miRNA-21表達水平。3

5、.基于分子信標實時監(jiān)測UDG酶活性方法的建立及其應用
　　本章以含有損傷堿基尿嘧啶的嵌合型分子信標作為酶促底物和信號報告分子，建立一種 UDG酶的分析方法。通過實時熒光的方法來進行 UDG酶的活性分析和對UDG酶的熱動力學進行考察。結果表明UDG的檢測下限可以達到0.005 U/ml，UDG酶的KM和kcat值分別為0.89±0.1μM和210±10 min-1。接著將其用于UDG酶抑制劑的篩選，發(fā)現5-氟尿嘧啶和順鉑具有顯著 U