熒光納米探針的制備及生物檢測應(yīng)用.pdf

1、生物體內(nèi)的一些生物分子，如氨基酸、蛋白質(zhì)、活性氧、陽離子、陰離子和中性分子等，在生物活動的調(diào)節(jié)過程中起著非常重要的作用。這些分子在生物體內(nèi)含量的異常可能是疾病的征兆或會引起一些疾病，甚至?xí)鸷芏鄧?yán)重的疾病如惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病如帕金森氏癥和阿爾茨海默氏綜合征。目前，在生物分析中常采用酶或底物，化學(xué)或生物發(fā)光體系和熒光物質(zhì)等作為檢測試劑。早期應(yīng)用廣泛的放射性同位素，因其對人體和環(huán)境有損害現(xiàn)已不常用。酶免疫分析法雖然不具有放射性污染的

2、問題，但是酶本身容易失去活性;化學(xué)和生物發(fā)光分析法的靈敏度雖然很高，但易受外部環(huán)境的影響，穩(wěn)定性也比較差，瞬間的化學(xué)反應(yīng)后，樣品的發(fā)光無法再現(xiàn)，結(jié)果的重現(xiàn)性差。近年來，基于熒光納米材料的光學(xué)檢測發(fā)展迅速，在疾病診斷、檢測分析等研究領(lǐng)域取得了卓越的成就。與傳統(tǒng)的光學(xué)生物檢測體系相比，熒光納米生物檢測體系具有靈敏度高，檢測迅速，動態(tài)范圍寬及可實時監(jiān)測等優(yōu)勢而在實際中得到了廣泛的應(yīng)用。
　　熒光納米探針是熒光納米生物檢測體系的核心部分，

3、與有機(jī)熒光探針相比，無機(jī)納米熒光探針具有熒光性能穩(wěn)定，不易發(fā)生光漂白，斯托克斯位移較大和熒光譜峰狹窄對稱等優(yōu)點(diǎn)。熒光納米探針在分子生物學(xué)、免疫生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域顯示出越來越誘人的應(yīng)用前景。在臨床醫(yī)學(xué)診斷中，由于大多數(shù)生物分子本身無熒光或熒光較弱，檢測靈敏度較差，利用強(qiáng)熒光探針對待測物進(jìn)行標(biāo)記，使檢出限大大降低。在醫(yī)學(xué)影像學(xué)中，熒光納米探針可進(jìn)行活體標(biāo)記監(jiān)測細(xì)胞或組織成像。在軍事醫(yī)學(xué)中，熒光納米探針能對生物毒素及時快速檢測是防

4、御生物武器的有效措施。熒光納米探針已應(yīng)用于檢測多種細(xì)菌、病毒及其毒素，還可以用來測量乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各種氨基酸以及各種致癌和癌變物質(zhì)。
　　熒光納米探針主要包括半導(dǎo)體量子點(diǎn)，金屬團(tuán)簇，碳量子點(diǎn)，硅量子點(diǎn)，石墨烯等納米材料，目前已經(jīng)被廣泛用于熒光納米生物檢測體系的構(gòu)建。量子點(diǎn)是由少量原子構(gòu)成的一種納米材料，外觀像一個極小的點(diǎn)狀物，因此而得名。量子點(diǎn)的三個維度的尺寸都在十納米以下，因此是一種典型的零維納米

5、材料。貴金屬納米團(tuán)簇是在一定的分子層保護(hù)下，由幾個到幾百個Au、Ag或Pt等貴金屬原子組成的相對穩(wěn)定的具熒光、水溶性的分子級聚集體。碳量子點(diǎn)是一種新型的熒光納米材料，不僅具有與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相似的熒光性能，而且還具有毒性低及生物相容性良好的優(yōu)點(diǎn)。
　　目的:
　　1、制備出熒光強(qiáng)，量子產(chǎn)率高的量子點(diǎn)和熒光金屬團(tuán)簇，并對其形貌，熒光性質(zhì)，穩(wěn)定性等進(jìn)行研究。
　　2、將量子點(diǎn)應(yīng)用于檢測有醫(yī)學(xué)診斷價值的生物分子，為臨床診斷提供

6、依據(jù)。
　　3、篩選兩種發(fā)射峰位相距合適，熒光顏色搭配合適的熒光探針，將其混合形成熒光比率探針，其中一種作為參照信號，另一種可作為響應(yīng)信號。
　　4、把熒光比率探針應(yīng)用于檢測有醫(yī)學(xué)診斷價值的生物分子，更準(zhǔn)確的定量生物分子的濃度。
　　5、通過一系列表征方法探究闡明熒光納米探針的檢測機(jī)理。
　　方法:
　　1、制備合成碲化鎘量子點(diǎn)(CdTe QDs)包裹二氧化硅(SiO2)的雜化球。利用水熱法將CdTe QD

7、s負(fù)載在SiO2的表面，形成帶有熒光的CdTe@SiO2 NPs。此雜化球保留了CdTe QDs的高量子產(chǎn)率，負(fù)載到SiO2上之后形成尺寸較大的熒光納米粒子，增加了生物相容性且容易分離?？商岣逤dTe QDs在生物診斷中的應(yīng)用價值。
　　2、合成BSA@Au NCs并初步構(gòu)建相應(yīng)檢測體系。制備出以牛血清白蛋白(BSA)為配體保護(hù)的金團(tuán)簇(Au NCs)，制備方法簡便快速。BSA@Au NCs生物相容性好、熒光強(qiáng)度高，在生物檢測和生

8、物標(biāo)記中具有較高應(yīng)用價值。我們將其初步用于構(gòu)建檢測過氧化氫(H2O2)的熒光檢測體系。
　　3、合成CDs并初步構(gòu)建相應(yīng)檢測體系。合成穩(wěn)定性、生物相容性好、熒光強(qiáng)的碳量子點(diǎn)(CDs)，CDs制備簡單、成本低且容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。因此，碳量子點(diǎn)在細(xì)胞標(biāo)記、細(xì)胞成像、醫(yī)療診斷、分析檢測等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。碳量子點(diǎn)作為一種綠色環(huán)保且具有優(yōu)異熒光性能的納米顆粒，是構(gòu)建熒光納米生物分子檢測體系的理想材料。我們將其初步用于構(gòu)建檢測多巴胺

9、濃度的檢測體系。
　　4、采用穩(wěn)定性和生物相容性好的BSA@Au NCs和CDs通過自組裝構(gòu)建了熒光納米比率探針，調(diào)整合適的配比和參數(shù)，將熒光比率探針用于簡單，快速，便捷，靈敏的檢測生物分子?；贑Ds/BSA@Au NCs的表面化學(xué)狀態(tài)發(fā)生改變的機(jī)理實現(xiàn)對自由基等進(jìn)行檢測，其中CDs作為參照信號，BSA@Au NCs作為響應(yīng)信號，同時根據(jù)兩種熒光顏色的變化可以實現(xiàn)可視化分析。
　　5、使用電子掃描電鏡，透射電鏡，傅里葉紅外

10、吸收分析儀，X射線光電子能譜，紫外-可見分光光度計，熒光分光光度計等多種表征手段研究探索熒光納米探針檢測的生物分子的機(jī)理。
　　本論文首先制備了三種不同材料的熒光納米探針，再分別用這三種熒光納米材料為探針構(gòu)建了檢測生物分子的體系。主要工作與結(jié)論如下:
　　1、創(chuàng)新性的使用水熱法制備了具有優(yōu)良熒光性能的熒光納米復(fù)合微球SiO2@CdTe NPs，制備方法簡便，效率高，尺寸可控;并對其光學(xué)特性和形貌及尺寸等進(jìn)行表征，形貌大小均一

11、，熒光穩(wěn)定。利用SiO2@CdTe NPs的熒光強(qiáng)度實現(xiàn)了對生物分子過氧化氫的檢測，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.005～0.1 mM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的兩段式線性關(guān)系，其檢測限經(jīng)優(yōu)化后可達(dá)到10nM。SiO2@CdTe NPs可以被離心分離重懸后再次用于檢測過氧化氫，可以重復(fù)利用的性能大大節(jié)約了檢測成本。
　　2、BSA@Au NCs和CDs兩種材料無毒易得，兩者混合可以通過自組裝形成穩(wěn)定性較好的熒光比率探針來檢測醫(yī)學(xué)生物分子。并用多種表征

12、手段表征其性質(zhì)。該比率探針具有降低干擾信號、材料易得無毒、提高準(zhǔn)確度和靈敏度等優(yōu)勢。其中，CDs作為參照信號，BSA@Au NCs作為響應(yīng)信號，實現(xiàn)了對過氧化氫和次氯酸根離子這兩種自由基的檢測,并得到良好的線性關(guān)系，基于對過氧化氫的檢測，構(gòu)建了一個可用于檢測能夠進(jìn)行酶反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫的葡萄糖的檢測體系，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，熒光比率試紙成功用于檢測過氧化氫的濃度，促進(jìn)了生物分子的肉眼可視化分析?？捎糜趯嶋H血清中檢測過氧化氫和葡萄糖的濃度

13、，并得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　3、采用生物相容性好的CDs為熒光探針構(gòu)建了一種簡單，快速簡便，靈敏的熒光檢測多巴胺濃度的體系，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，該CDs在堿性條件下對多巴胺具有很高的靈敏度，檢測限達(dá)到1nM。研究發(fā)現(xiàn)該CDs是對醌結(jié)構(gòu)比較敏感，并用多種表征手段分析了其敏感機(jī)理，醌結(jié)構(gòu)會對碳量子點(diǎn)表面的羧基和氨基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致CDs不同程度的淬滅。基于這個反應(yīng)機(jī)理，實現(xiàn)了CDs對臨床常用抗癌醌類藥物鹽酸米托蒽醌和阿霉素的檢測，并建立了