分子與納米乏氧熒光探針的設(shè)計(jì)合成及生物應(yīng)用.pdf

1、惡性腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中,由于缺氧所引發(fā)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)換(EMT),正在受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而缺乏有效地檢測(cè)方法用來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的缺氧,從而阻礙了細(xì)胞內(nèi)依賴于缺氧的 EMT機(jī)制的研究。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一種近紅外的熒光探針(Cy-NO2)通過(guò)檢測(cè)硝基還原酶對(duì)缺氧的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。硝基還原酶的檢測(cè)機(jī)制是基于選擇性催化硝基還原為氨基并且以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為電子源。該探針對(duì)硝基還原酶的熒光增強(qiáng)效應(yīng)有很強(qiáng)的選擇性和敏感性,更重要

2、的是探針能成功的顯示 EMT與細(xì)胞內(nèi)低氧水平之間的關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白對(duì)于花菁類探針的熒光成像有一定程度的影響,多孔核殼結(jié)構(gòu)二氧化硅包覆的納米熒光探針可以減小甚至消除這種影響。
　　本文綜述了檢測(cè)缺氧的熒光探針的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)。對(duì)小分子熒光探針進(jìn)行了生物化學(xué)體系分析以及生物熒光成像分析,并且以分子探針為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)合成了一種新型介孔硅-分子熒光探針。具體如下:
　　1.本文設(shè)計(jì)了一種近紅外的熒光探針(Cy-NO2)通過(guò)檢測(cè)

3、硝基還原酶對(duì)缺氧的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。硝基還原酶的檢測(cè)缺氧的機(jī)制是基于選擇性的將硝基催化還原為氨基而且以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸作為還原過(guò)程中的電子源。該探針對(duì)硝基還原酶的熒光增強(qiáng)效應(yīng)有很強(qiáng)的選擇性和敏感性,更重要的是探針成功的調(diào)查了 EMT與細(xì)胞內(nèi)低氧水平之間的關(guān)系,本文以2-(2-硝基咪唑)乙胺當(dāng)作對(duì)硝基還原酶(NTR)具有特異性的響應(yīng)基團(tuán),并且以花菁為母體熒光團(tuán)設(shè)計(jì)并合成了用來(lái)指示腫瘤內(nèi)缺氧區(qū)域的近紅外熒光探針。這個(gè)探針的發(fā)射在近紅

4、外區(qū)域,然而一般生物體的自體熒光卻不在近紅外區(qū)域,因此該探針在避免生物體自體熒光方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在氧氣濃度比較低時(shí),生物化學(xué)體系中的硝基基團(tuán)與加入的肝微粒體和NADPH發(fā)生反應(yīng),硝基被特異性的還原為氨基;在生物體內(nèi),硝基還原酶與輔酶(NADH或NADPH)把硝基最終還原成氨基。利用硝基和氨基的吸電子效應(yīng)和供電子效應(yīng)對(duì)探針的熒光性質(zhì)產(chǎn)生的差異性影響:硝基對(duì)花菁熒光團(tuán)的的強(qiáng)烈的猝滅作用使缺氧探針發(fā)出較弱的熒光,而硝基被還原為氨基后,熒光

5、迅速升高,從而成功的對(duì)乏氧進(jìn)行了檢測(cè)。在肝微粒體和 NADPH體系中,肝微粒體的濃度范圍是0-13μg/mL,線性方程為F=37.466+16.118[liver microsomes](μg/mL),線性相關(guān)系數(shù)為0.9989,檢測(cè)限為0.65 ng/mL,說(shuō)明探針可以對(duì)較低濃度的硝基還原酶進(jìn)行檢測(cè)。此外,在生物體內(nèi)的一些還原性物質(zhì):VC、GSH、Arg、DTT等對(duì)探針沒(méi)有干擾。通過(guò)缺氧和常氧條件下的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)可以看出缺氧探針具有良

6、好的生物相容性和較高的水溶性、較低的細(xì)胞毒性,可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)的缺氧程度進(jìn)行可視化研究。EMT實(shí)驗(yàn)證明該探針能夠通過(guò)監(jiān)控缺氧來(lái)監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)某些與EMT相關(guān)蛋白的變化。
　　2.因?yàn)橄趸溥蚍肿臃ρ跆结樀目构馄仔阅茌^差,量子產(chǎn)率較低,而且在細(xì)胞內(nèi)容易受到一些大分子蛋白的影響使其熒光背景較高,這樣就很大程度上限制了探針的信噪比,因此我們?cè)O(shè)計(jì)了一種多孔硅包覆的乏氧探針(Cy-NO2@SiO2),具體方案是將硝基咪唑乏氧探針包覆在介孔硅的內(nèi)部

7、,使其與外面的大分子蛋白隔離,但是硝基還原酶還可以通過(guò)孔道與硝基咪唑乏氧探針進(jìn)行電子傳遞,從而使分子探針被還原發(fā)出強(qiáng)的熒光。因?yàn)榇蠓肿拥鞍撞荒軐?duì)多孔硅內(nèi)部的硝基咪唑乏氧探針產(chǎn)生影響,因而這種方案可以有效地降低探針由于干擾所產(chǎn)生的熒光背景,而且分子探針與納米材料相連接限制了其結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)提高了探針的抗光漂白性能,提高了其量子產(chǎn)率,可以很大的提高探針的信噪比。此外,該探針有較好的生物相容性,在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行熒光成像時(shí)可以有效地避免大分子蛋白對(duì)探針