氨基菁類乏氧熒光探針的合成和性能研究.pdf

1、乏氧（Hypoxia）作為惡性腫瘤的特征之一，在腫瘤的生長(zhǎng)調(diào)控中扮演著重要的角色。研究腫瘤乏氧可以對(duì)腫瘤的檢測(cè)與治療提供更加有力的手段，而在眾多乏氧檢測(cè)技術(shù)中，小分子熒光探針由于其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、響應(yīng)靈敏等優(yōu)勢(shì)被廣泛用于腫瘤乏氧的檢測(cè)。硝基還原酶（NTR）在腫瘤乏氧細(xì)胞內(nèi)往往會(huì)大量表達(dá)，因此其可以作為檢測(cè)腫瘤乏氧的重要指標(biāo)。目前基于硝基還原酶的乏氧探針有很多，但近紅外熒光探針卻并不多見，尤其是吸收和發(fā)射均在近紅外區(qū)域（>700 nm）的乏氧熒

2、光探針。另外，基于氨基菁類熒光染料的近紅外乏氧探針更是少有報(bào)道，因此設(shè)計(jì)合成新型的近紅外乏氧探針是在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上的一個(gè)有力補(bǔ)充，也能更好地推動(dòng)熒光探針在生物成像上的應(yīng)用。本文對(duì)現(xiàn)有的乏氧熒光探針做了一個(gè)簡(jiǎn)單的綜述，然后在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)合成了一系列新型的近紅外乏氧熒光探針，并研究了其在乏氧成像方面的應(yīng)用。
　　本文首先以對(duì)硝基芐基作為乏氧標(biāo)記物、以哌嗪橋連取代的氨基菁類熒光染料CyNP為母體設(shè)計(jì)合成了兩類檢測(cè)硝基還原酶的近紅

3、外乏氧熒光探針CyNP1和CyNP2，并通過(guò)質(zhì)譜和 HPLC檢測(cè)驗(yàn)證了探針對(duì)硝基還原酶的響應(yīng)機(jī)理。CyNP1在緩沖溶液中的熒光淬滅非常徹底，而在硝基還原酶和NADH的作用下，CyNP1在10分鐘之內(nèi)就能迅速恢復(fù)大部分熒光，總的熒光增強(qiáng)能達(dá)到近40倍；而CyNP2對(duì)硝基還原酶響應(yīng)之后只有2.5倍的熒光增強(qiáng)，而且熒光增強(qiáng)之后還會(huì)有輕微的減弱。質(zhì)譜和HPLC結(jié)果顯示，CyNP1對(duì)硝基還原酶響應(yīng)并生成氨基化合物之后會(huì)發(fā)生重排-消除反應(yīng)并最終生成

4、母體染料CyNP，而CyNP2則只能生成硝基還原過(guò)程中的一個(gè)中間體亞硝基化合物。因此對(duì)比兩類探針，CyNP1顯示出更加優(yōu)異的硝基還原酶檢測(cè)能力。另外，探針CyNP1在其它還原性物質(zhì)存在下均沒(méi)有明顯的熒光變化，表現(xiàn)出了對(duì)硝基還原酶的特異性響應(yīng)。在細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中，CyNP1在乏氧條件和常氧條件下的細(xì)胞成像圖有著非常明顯的區(qū)別，其中常氧條件下的Hela細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到熒光，而Hela細(xì)胞在乏氧條件下培養(yǎng)之后卻能檢測(cè)到明顯的熒光。當(dāng)在乏氧細(xì)胞中

5、加入一種硝基還原酶的抑制劑-雙香豆素之后，乏氧細(xì)胞內(nèi)完全檢測(cè)不到熒光。這些結(jié)果表明 CyNP1可以很好的用于硝基還原酶和腫瘤乏氧的檢測(cè)。
　　為了探索波長(zhǎng)更長(zhǎng)的近紅外乏氧探針，本文又以對(duì)硝基苯甲?；鳛榉ρ鯓?biāo)記物、以氨基菁類熒光染料為母體設(shè)計(jì)合成了兩類近紅外乏氧探針CyN1和CyNP3，并首次通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)探討了硝基還原酶對(duì)硝基類乏氧探針的催化還原機(jī)理。兩類探針的最大吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)均在700 nm以上的近紅外區(qū)域，其中CyN1的

6、最大發(fā)射更是達(dá)到了800 nm以上，是目前報(bào)道的熒光增強(qiáng)型乏氧探針中吸收和發(fā)射波長(zhǎng)最長(zhǎng)的熒光探針。兩類乏氧探針均對(duì)硝基還原酶有明顯的熒光響應(yīng)，熒光增強(qiáng)都能達(dá)到5倍左右，其中CyNP3對(duì)硝基還原酶響應(yīng)十分迅速，5分鐘之內(nèi)基本能恢復(fù)大部分熒光。另外質(zhì)譜結(jié)果顯示，硝基還原酶對(duì)硝基類乏氧探針的催化還原過(guò)程主要涉及三類化合物，包括亞硝基化合物、羥胺類化合物以及氨基化合物，而探針CyN1和CyNP3的熒光增強(qiáng)主要來(lái)自催化還原過(guò)程的中間產(chǎn)物亞硝基化合